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crazymouse66金蟲 (正式寫手)
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絕對定量熒光PCR中做標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA的獲得。
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| 蟲友們好，最近我想用16SRNA做一下土壤總DNA的 絕對定量熒光PCR，在這之前要做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，我就想問一下，做標(biāo)準(zhǔn)曲線時的已知濃度的DNA是怎么獲得的？而且我接下來做的是從土壤中提取的中DNA的16sRNA的熒光定量PCR，因此我做標(biāo)準(zhǔn)曲線的一直濃度的DNA有什么要求嗎？請大家?guī)蛶兔��；蛘呓o我相應(yīng)的參考文獻(xiàn)也可以，謝謝大家。 |
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wubingqi
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crazymouse66: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 真的非常感謝，我以前都沒做過這個，所以對此很不熟悉，謝謝你的幫助，讓我大概有了一些了解，我先自己再查閱一些文獻(xiàn)，有不懂的再請教您，謝謝啊。 2013-05-07 11:20:07
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這個最好是用帶有目的片段的質(zhì)粒作標(biāo)準(zhǔn)曲線，因?yàn)橘|(zhì)粒相對穩(wěn)定，不易降解。你首先要選擇一個16s rDNA序列測定完畢的純菌，你可以從的環(huán)境樣品中隨便分離一個細(xì)菌，用高保真酶擴(kuò)增16s rDNA保守區(qū)域（比如V3區(qū)），然后通過連接載體轉(zhuǎn)化后測序，然后你就知道這個片段(V3)的精確大小了。然后，重新用擴(kuò)增那個細(xì)菌的這個片段（V3）,pcr產(chǎn)物連接合適的載體（單克隆質(zhì)粒，并只有一個克隆位點(diǎn)的），連接成功后轉(zhuǎn)化，搖菌培養(yǎng)，然后從搖好的菌液中再提取這個帶有目的片段質(zhì)粒。下一步就是測定質(zhì)粒的濃度和純度了，測OD值即可，一般來說260nm吸光度下，1OD≈50mg/mL雙鏈DNA，這樣你就知道了你提取的帶有目的片段的質(zhì)粒的濃度了。因?yàn)檩d體的大小和目的片段（那個V3區(qū)）大小都已知，然后通過公式即可算出質(zhì)粒的拷貝數(shù)，這個質(zhì)粒的拷貝數(shù)和目的片段的拷貝數(shù)是一樣的。最后，將這個質(zhì)粒進(jìn)行5倍或是10倍的梯度稀釋，用這一系列的質(zhì)粒上機(jī)熒光定量PCR做標(biāo)準(zhǔn)曲線就行了。 早上比較忙，介紹的有點(diǎn)混亂，不好意思 |
2樓2013-05-07 09:10:44
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3樓2013-05-10 09:03:55
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你看下《土壤中粉紅粘帚霉67_1熒光定量PCR監(jiān)測體系的建立及應(yīng)用》這個論文吧，時間久了，只記得這么一個了。 |
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4樓2013-05-10 09:22:12
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