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crazymouse66金蟲 (正式寫手)
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絕對(duì)定量熒光PCR中做標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA的獲得。
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| 蟲友們好，最近我想用16SRNA做一下土壤總DNA的 絕對(duì)定量熒光PCR，在這之前要做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，我就想問一下，做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的已知濃度的DNA是怎么獲得的？而且我接下來做的是從土壤中提取的中DNA的16sRNA的熒光定量PCR，因此我做標(biāo)準(zhǔn)曲線的一直濃度的DNA有什么要求嗎？請(qǐng)大家?guī)蛶兔�。或者給我相應(yīng)的參考文獻(xiàn)也可以，謝謝大家。 |
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送紅花一朵 | 您好，我最近也在做土壤微生物QPCR,但是困在了標(biāo)曲這塊，想請(qǐng)問您一些關(guān)于制作標(biāo)曲的問題！我理解的制作標(biāo)曲的步驟是：提取土壤基因組；引物擴(kuò)增；擴(kuò)增片段與載體連接轉(zhuǎn)入感受態(tài)中；從中篩選幾個(gè)陽(yáng)性克隆去測(cè)序。我想請(qǐng)教的是，這個(gè)方法對(duì)不？另外為什么要篩選幾個(gè)陽(yáng)性克��？希望您能指導(dǎo)一下，另外希望您給幫忙推薦幾篇詳細(xì)介紹的文章，嘿嘿…… |
8樓2014-11-29 19:54:55
wubingqi
木蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
crazymouse66: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 真的非常感謝，我以前都沒做過這個(gè)，所以對(duì)此很不熟悉，謝謝你的幫助，讓我大概有了一些了解，我先自己再查閱一些文獻(xiàn)，有不懂的再請(qǐng)教您，謝謝啊。 2013-05-07 11:20:07
zhang8826857: 金幣+5, MicEPI+1, good 2013-05-10 16:27:48
zhang8826857: 有興趣來做本版的專家嗎？ 2013-05-10 16:28:12
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zhang8826857: 有興趣來做本版的專家嗎？ 2013-05-10 16:28:12
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這個(gè)最好是用帶有目的片段的質(zhì)粒作標(biāo)準(zhǔn)曲線，因?yàn)橘|(zhì)粒相對(duì)穩(wěn)定，不易降解。你首先要選擇一個(gè)16s rDNA序列測(cè)定完畢的純菌，你可以從的環(huán)境樣品中隨便分離一個(gè)細(xì)菌，用高保真酶擴(kuò)增16s rDNA保守區(qū)域（比如V3區(qū)），然后通過連接載體轉(zhuǎn)化后測(cè)序，然后你就知道這個(gè)片段(V3)的精確大小了。然后，重新用擴(kuò)增那個(gè)細(xì)菌的這個(gè)片段（V3）,pcr產(chǎn)物連接合適的載體（單克隆質(zhì)粒，并只有一個(gè)克隆位點(diǎn)的），連接成功后轉(zhuǎn)化，搖菌培養(yǎng)，然后從搖好的菌液中再提取這個(gè)帶有目的片段質(zhì)粒。下一步就是測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度了，測(cè)OD值即可，一般來說260nm吸光度下，1OD≈50mg/mL雙鏈DNA，這樣你就知道了你提取的帶有目的片段的質(zhì)粒的濃度了。因?yàn)檩d體的大小和目的片段（那個(gè)V3區(qū)）大小都已知，然后通過公式即可算出質(zhì)粒的拷貝數(shù)，這個(gè)質(zhì)粒的拷貝數(shù)和目的片段的拷貝數(shù)是一樣的。最后，將這個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行5倍或是10倍的梯度稀釋，用這一系列的質(zhì)粒上機(jī)熒光定量PCR做標(biāo)準(zhǔn)曲線就行了。 早上比較忙，介紹的有點(diǎn)混亂，不好意思 |
2樓2013-05-07 09:10:44
crazymouse66
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3樓2013-05-10 09:03:55
wubingqi
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你看下《土壤中粉紅粘帚霉67_1熒光定量PCR監(jiān)測(cè)體系的建立及應(yīng)用》這個(gè)論文吧，時(shí)間久了，只記得這么一個(gè)了。 |
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4樓2013-05-10 09:22:12
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