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fanchuannan銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
最近做原核表達(dá)，有些問題求大神幫助啊
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本人本科新手一枚，最近用BL21表達(dá)一個(gè)GST標(biāo)簽的融合蛋白，正在做小量表達(dá)，質(zhì)粒是學(xué)長(zhǎng)構(gòu)的。 說一下以前做的大體流程吧： 轉(zhuǎn)化涂板42度過夜，挑菌，5ml LB 37度200r培養(yǎng)6h 提質(zhì)粒檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒 接菌1：1000于40ml LB，37度培養(yǎng)3小時(shí)后加IPTG至1mmolperL，28度過夜誘導(dǎo) 收菌3ml加20ul 2Xbuffer，煮十分鐘，瞬離，全部上樣。。。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)一團(tuán)糟啊一團(tuán)糟，電泳條帶發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)跟沒誘導(dǎo)沒什么變化，而且條帶顏色都很深 自己總結(jié)一下可能出錯(cuò)的地方： 1.接菌比例太小，3小時(shí)培養(yǎng)后可能還沒有到0.6或者連0.4都沒到就加IPTG了，所以又到效果不好 2.IPTG濃度加的太多，是不是這次應(yīng)該做一個(gè)梯度來看一看，0.1,0.3,0.6,0.8,1.0 3.上樣之前是不是應(yīng)該先用100ulPBS懸菌然后再加2Xbuffer煮沸 4.煮沸以后是不是應(yīng)該離心時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)然后取上清點(diǎn)樣��？以前點(diǎn)的樣在點(diǎn)樣孔那里沉積了好多細(xì)胞碎片之類的東西 再求做原核表達(dá)的大神給點(diǎn)意見啊。�！，F(xiàn)在小量的做不好后面的大量培養(yǎng)提蛋白也沒法做。。。痛苦中啊 1跟4是加IPTG的，2跟5是未加IPTG的,4跟6是marker 2013-04-30 15.12.28.jpg |
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feixiang1209
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【答案】應(yīng)助回帖
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fanchuannan: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-05-13 23:51:13
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過程沒什么太大問題，你自己總結(jié)的那幾點(diǎn)都不會(huì)特別的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是你這點(diǎn)用跑的太差了，跑成這樣就算有區(qū)別也看不出來了。是不是膠配的不好？下次電壓或者電流稍微小點(diǎn)，上樣量也有點(diǎn)太多，建議重跑次電泳先看看，起碼得條帶明顯了才能比較。 如果確實(shí)是沒有結(jié)果的話，可以試試1:40接菌搖倆小時(shí)加IPTG，濃度暫時(shí)不用變，這是最適表達(dá)濃度，如果要可溶表達(dá)的話再去摸索濃度，現(xiàn)在得起碼保證它表達(dá)才行。可以用37度誘導(dǎo)，還是那句話，先確定它表達(dá)了之后再摸索如何讓它可溶表達(dá)。 |
2樓2013-05-12 19:33:17
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7樓2013-07-30 16:23:16
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