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fanchuannan銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
最近做原核表達，有些問題求大神幫助啊
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本人本科新手一枚，最近用BL21表達一個GST標簽的融合蛋白，正在做小量表達，質粒是學長構的。 說一下以前做的大體流程吧： 轉化涂板42度過夜，挑菌，5ml LB 37度200r培養(yǎng)6h 提質粒檢驗發(fā)現(xiàn)有質粒 接菌1：1000于40ml LB，37度培養(yǎng)3小時后加IPTG至1mmolperL，28度過夜誘導 收菌3ml加20ul 2Xbuffer，煮十分鐘，瞬離，全部上樣。。。 結果發(fā)現(xiàn)一團糟啊一團糟，電泳條帶發(fā)現(xiàn)誘導跟沒誘導沒什么變化，而且條帶顏色都很深 自己總結一下可能出錯的地方： 1.接菌比例太小，3小時培養(yǎng)后可能還沒有到0.6或者連0.4都沒到就加IPTG了，所以又到效果不好 2.IPTG濃度加的太多，是不是這次應該做一個梯度來看一看，0.1,0.3,0.6,0.8,1.0 3.上樣之前是不是應該先用100ulPBS懸菌然后再加2Xbuffer煮沸 4.煮沸以后是不是應該離心時間長一點然后取上清點樣�。恳郧包c的樣在點樣孔那里沉積了好多細胞碎片之類的東西 再求做原核表達的大神給點意見啊。�！，F(xiàn)在小量的做不好后面的大量培養(yǎng)提蛋白也沒法做。。。痛苦中啊 1跟4是加IPTG的，2跟5是未加IPTG的,4跟6是marker 2013-04-30 15.12.28.jpg |
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【答案】應助回帖
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過程沒什么太大問題，你自己總結的那幾點都不會特別的影響實驗結果。但是你這點用跑的太差了，跑成這樣就算有區(qū)別也看不出來了。是不是膠配的不好？下次電壓或者電流稍微小點，上樣量也有點太多，建議重跑次電泳先看看，起碼得條帶明顯了才能比較。 如果確實是沒有結果的話，可以試試1:40接菌搖倆小時加IPTG，濃度暫時不用變，這是最適表達濃度，如果要可溶表達的話再去摸索濃度，現(xiàn)在得起碼保證它表達才行�？梢杂�37度誘導，還是那句話，先確定它表達了之后再摸索如何讓它可溶表達。 |
2樓2013-05-12 19:33:17
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5樓2013-05-12 23:02:25
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