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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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袁1231

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[求助] 求助western blot問題

大家能幫我看下，這個(gè)是什么問題嗎？western 新手。
前兩張圖，一張是SDS-PAGE 膠染色后，一張是轉(zhuǎn)膜后western. 什么都看不出來(lái)。后兩個(gè)都是western，背景很強(qiáng)，大家覺得我改怎么做？已經(jīng)是用10%的牛奶block了，難道我要換BSA試試？還是我一抗二抗的濃度加高了？謝謝大家。

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1樓 2013-06-02 06:26:54

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cicelyzh

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wizardfan: 金幣+2, 謝謝分析 2013-06-04 09:13:10

背景很深一般是二抗?jié)舛忍呋蛘呦茨げ怀浞郑袝r(shí)候也是因?yàn)橐豢共皇呛芎�。你可以先試試增加二抗的稀釋倍�?shù)，不行的話適當(dāng)調(diào)整一抗的稀釋倍數(shù)和上樣量。

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2樓2013-06-03 01:51:27

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JinGang0317

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wizardfan: 金幣+1, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-06-04 09:13:24

你第一張轉(zhuǎn)膜的圖片，讓我想起自己之前做過一次實(shí)驗(yàn)，是海綿墊只放了一個(gè)，導(dǎo)致蛋白都跑過了，直接轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液里了。你是不是也跟我犯了一樣的錯(cuò)誤？？

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靜下心來(lái)、

3樓2013-06-03 07:35:07

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3樓: Originally posted by JinGang0317 at 2013-06-03 07:35:07
你第一張轉(zhuǎn)膜的圖片，讓我想起自己之前做過一次實(shí)驗(yàn)，是海綿墊只放了一個(gè)，導(dǎo)致蛋白都跑過了，直接轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液里了。你是不是也跟我犯了一樣的錯(cuò)誤？？

不是，不過我的蛋白比較小，只有16， 21KD，難道真的轉(zhuǎn)過了？我是350 mA, 1h。要不我把所有抗體都strip了，用考馬斯染一下吧。謝謝啊。

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4樓2013-06-04 02:32:59

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗?jié)舛忍呋蛘呦茨げ怀浞郑袝r(shí)候也是因?yàn)橐豢共皇呛芎谩Ｄ憧梢韵仍囋囋黾佣沟南♂尡稊?shù)，不行的話適當(dāng)調(diào)整一抗的稀釋倍數(shù)和上樣量。

我二抗是1:10000稀釋的，用的pierce ECL試劑檢測(cè)，貌似也不濃，我用的PVDF膜，看網(wǎng)上說(shuō)nitrocellulose可能會(huì)好一些，你說(shuō)我是不是要重跑呢？

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5樓2013-06-04 02:35:10

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:51:27
背景很深一般是二抗?jié)舛忍呋蛘呦茨げ怀浞�，但有時(shí)候也是因?yàn)橐豢共皇呛芎�。你可以先試試增加二抗的稀釋倍�?shù)，不行的話適當(dāng)調(diào)整一抗的稀釋倍數(shù)和上樣量。

我一抗是先沖一遍，然后3*5min，二抗是先沖一遍，然后3*10min. 據(jù)說(shuō)洗脫了不好，我就擔(dān)心是不是因?yàn)樾盘?hào)太弱了，所以背景就強(qiáng)了，就更不敢洗了。

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6樓2013-06-04 02:38:41

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袁1231: 金幣+1 2013-06-04 06:48:46

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6樓: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 02:38:41
我一抗是先沖一遍，然后3*5min，二抗是先沖一遍，然后3*10min. 據(jù)說(shuō)洗脫了不好，我就擔(dān)心是不是因?yàn)樾盘?hào)太弱了，所以背景就強(qiáng)了，就更不敢洗了。...

一般的洗膜不會(huì)洗過的，充分洗膜可以減少背景，尤其是對(duì)特異性差的抗體。我一般是一抗和二抗后分別洗5次。不同公司的二抗可能效價(jià)不同，即使有建議稀釋倍數(shù)，還是要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的情況稍微優(yōu)化一下。

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7樓2013-06-04 05:00:36

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7樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-04 05:00:36
一般的洗膜不會(huì)洗過的，充分洗膜可以減少背景，尤其是對(duì)特異性差的抗體。我一般是一抗和二抗后分別洗5次。不同公司的二抗可能效價(jià)不同，即使有建議稀釋倍數(shù)，還是要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的情況稍微優(yōu)化一下。...

謝謝，你如果轉(zhuǎn)膜對(duì)于大蛋白和小蛋白，你都用什么條件呢？別人告訴我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一樣啊？我一個(gè)150k, 一個(gè)16 k。按這個(gè)條件，我發(fā)現(xiàn)ladder 都在的，但是今天發(fā)現(xiàn)我16k的那張膜上除了ladder，什么都沒有，不知道是被我strip掉了還是就是沒轉(zhuǎn)上或者轉(zhuǎn)過了。我一個(gè)strip了3次。另外PVDF和nitrocellulose是不是轉(zhuǎn)膜也不一樣呢？

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8樓2013-06-04 06:52:22

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袁1231: 金幣+2 2013-06-05 10:59:19

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8樓: Originally posted by 袁1231 at 2013-06-04 06:52:22
謝謝，你如果轉(zhuǎn)膜對(duì)于大蛋白和小蛋白，你都用什么條件呢？別人告訴我350 mA 1hr, 可是不同蛋白大小是不是不一樣�。课乙粋€(gè)150k, 一個(gè)16 k。按這個(gè)條件，我發(fā)現(xiàn)ladder 都在的，但是今天發(fā)現(xiàn)我16k的那張膜上除了lad ...

轉(zhuǎn)膜和電泳的原理差不多，大蛋白跑得慢，小蛋白跑得快，所以轉(zhuǎn)小蛋白所用的時(shí)間少一些，也可以適當(dāng)降低電流。轉(zhuǎn)膜的情況可以把膠染一下看看有沒有殘留。染膜當(dāng)然也可以的，但染膜的反差比膠要差。如果用麗春紅這樣的染料，靈敏度不高，所以有時(shí)候看不到。我轉(zhuǎn)NC膜用的條件與PVDF的一樣，只是膜的性質(zhì)不同，NC膜是親水的，而且比較脆，操作的時(shí)候要小心一點(diǎn)。

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9樓2013-06-04 11:00:48

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