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Pushing2012金蟲 (正式寫手)
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[求助]
雙酶切后轉(zhuǎn)化
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| 本人將載體pet28（5400bp左右）和目的基因（1000bp）做雙酶切(bamH1, Not1）后，連接，然后轉(zhuǎn)化，每次平板上都長一大堆菌落出來，反復(fù)挑了24個單克隆，一個都沒有裝進目的基因的，而且電泳檢測發(fā)現(xiàn)單克隆中提取的質(zhì)粒大小僅有3000-4000bp. 將酶切產(chǎn)物檢測發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)3條帶以上，這個酶切后出現(xiàn)多條帶shi怎么回事？還有為啥沒有陽性克隆出現(xiàn)，而且比空載體還��？我都要崩潰了，請各位大蝦幫幫忙。 |
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bullfrog325
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一般來說，克隆是出現(xiàn)大量的背景克隆的主要原因就是載體的酶切處理出了問題。 建議： 1）首先，建議進行單酶切分析，看看在你的酶切條件下，單酶切是否徹底。 2）設(shè)置空載體的連接反應(yīng)對照，以進一步分析雙酶切是否徹底。 更具體的操作方案，可以參見http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html 其實，將量化的概念引入到分子克隆中，實驗就相對可控了。 |
3樓2013-06-14 22:13:38
cicelyzh
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轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒直接跑電泳不太好直接估計分子量，最好做單酶切成線狀后再與marker比，同時你可以切一個空載體作為對照，很容易通過比較看出是否連入1kb的片段。 酶切出現(xiàn)多條帶可能是酶切不完全造成的。你最好跑一個質(zhì)粒做對照。 我覺得你先確定一下轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒大小，跑到3000-4000的超螺旋質(zhì)粒的實際大小一般要比這大得多。你說的這個范圍太廣又沒有圖，不好判斷是否連進去了。簡單的做法是跑一個空載體質(zhì)粒與之比較。如果看不出來可以分別做單酶切成線狀分子后比較。酶切時注意根據(jù)質(zhì)粒的量加酶。 |
4樓2013-06-15 03:27:09
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8樓2013-06-26 21:20:12
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