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wjw3188木蟲 (著名寫手)
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表達(dá)載體構(gòu)建
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大家好，最近做表達(dá)出現(xiàn)了一點(diǎn)問題：首先，我將片段連接到T載體上，然后用相應(yīng)酶（Bgl I 和Kpn I）酶切下來(lái)，回收后連接到載體pET-32a上，用T7引物PCR擴(kuò)增，有目標(biāo)條帶，且單一明亮，可是提取質(zhì)粒后，用同樣的酶進(jìn)行雙酶切卻切不開，不知道為什么？？？當(dāng)初選擇酶切位點(diǎn)的時(shí)候請(qǐng)教了別人，告訴我pET-32a上的酶切位點(diǎn)可以挨著，因?yàn)橛X得保證載體的完整性會(huì)好一點(diǎn)，所以我就選擇了兩個(gè)挨著的酶切位點(diǎn)，現(xiàn)在切不開是不是因?yàn)檫@個(gè)，還是其他原因？求高手解答！！ [ 來(lái)自小組 Rose Family ] |
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cicelyzh
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| 酶切位點(diǎn)相鄰的確有可能降低切割效率，不過(guò)我認(rèn)為不是這個(gè)問題。因?yàn)槿绻阕隹寺r(shí)候能切開空的pET32a載體，說(shuō)明即使這兩個(gè)位點(diǎn)相鄰也能夠切開。而插入目的片段后兩個(gè)位點(diǎn)已經(jīng)不相鄰了，切不下來(lái)可能是你的限制酶有問題。你試試用單酶切是否能切成線性分子，比較構(gòu)建載體的大小是否比空載體大。你還可以試試換其他限制酶切。 |
2樓2013-06-18 01:02:07
wjw3188
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8樓2013-06-29 11:26:29
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