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wjw3188木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
表達(dá)載體構(gòu)建
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大家好，最近做表達(dá)出現(xiàn)了一點(diǎn)問(wèn)題：首先，我將片段連接到T載體上，然后用相應(yīng)酶（Bgl I 和Kpn I）酶切下來(lái)，回收后連接到載體pET-32a上，用T7引物PCR擴(kuò)增，有目標(biāo)條帶，且單一明亮，可是提取質(zhì)粒后，用同樣的酶進(jìn)行雙酶切卻切不開(kāi)，不知道為什么？？？當(dāng)初選擇酶切位點(diǎn)的時(shí)候請(qǐng)教了別人，告訴我pET-32a上的酶切位點(diǎn)可以挨著，因?yàn)橛X(jué)得保證載體的完整性會(huì)好一點(diǎn)，所以我就選擇了兩個(gè)挨著的酶切位點(diǎn)，現(xiàn)在切不開(kāi)是不是因?yàn)檫@個(gè)，還是其他原因？求高手解答��！ [ 來(lái)自小組 Rose Family ] |
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wjw3188
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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9樓2013-06-29 11:27:38
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wjw3188(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細(xì)的解答。 2013-06-18 10:52:36
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| 酶切位點(diǎn)相鄰的確有可能降低切割效率，不過(guò)我認(rèn)為不是這個(gè)問(wèn)題。因?yàn)槿绻阕隹寺r(shí)候能切開(kāi)空的pET32a載體，說(shuō)明即使這兩個(gè)位點(diǎn)相鄰也能夠切開(kāi)。而插入目的片段后兩個(gè)位點(diǎn)已經(jīng)不相鄰了，切不下來(lái)可能是你的限制酶有問(wèn)題。你試試用單酶切是否能切成線性分子，比較構(gòu)建載體的大小是否比空載體大。你還可以試試換其他限制酶切。 |
2樓2013-06-18 01:02:07
ivyvampire
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3樓2013-06-18 13:01:16
冰風(fēng)顫木
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4樓2013-06-20 11:05:44
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