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小科研女dow木蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白表達(dá)不出來，是什么原因造成的 已有1人參與
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各位蟲友，我之前一直在做基因文庫，好不容易從文庫中篩到了具有我要的酶活性的克隆子。但是通過測序，是一條具有好幾個閱讀框的基因片段，但是發(fā)現(xiàn)并沒有相似甚至相關(guān)的酶的基因，都是一些膜蛋白組件，還有幾個是沒有報道的未知蛋白，可是通過活性檢測，明明是有活性的。 我的做法就是，將測序結(jié)果分析閱讀框，挑了幾個較大的閱讀框（2000bp-500bp）都分別設(shè)計引物克隆表達(dá)，但是都做了4個了，都沒有表達(dá)出蛋白，是一點都沒有啊。 請問這是怎么回事？是不是不是所有的完整閱讀框都能表達(dá)蛋白，只是有功能性的蛋白可以表達(dá)？ |
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 | 實驗技術(shù)、方法交流 |
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7樓2014-08-18 01:13:49
凌波麗
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-06-22 18:47:33
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kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-06-22 18:47:33
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你是在原核細(xì)胞中表達(dá)？我先按照這個說，若不是你說出來，我在按照真核表達(dá)系統(tǒng)說。 克隆金銀的表達(dá)，除了需要啟動子外，還要Shine-Dalgarno Sequence (SD序列）。Shine-Dalgarno Sequence一般位于-10及翻譯起始密碼子ATG之間，是mRNA與16SrRNA結(jié)合時所必須。Shine-Dalgarno Sequence與翻譯起始密碼子ATG之間的距離會影響基因的表達(dá)。此距離的大小與不同的啟動子有關(guān)，一般7-9個堿基。 |
2樓2013-06-20 21:53:35
凌波麗
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3樓2013-06-20 21:59:37
凌波麗
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵交流 2013-06-22 18:49:41
kx444555: 金幣+5, 鼓勵交流 2013-06-22 18:49:41
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高效質(zhì)粒載體表達(dá)外源基因的一般方法（原核表達(dá)系統(tǒng)）: （1）表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計：構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點序列的變化對 mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：SD序列 UAAGGAGG的翻譯效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是6-8個堿基長度，與 AAGAA 的最適距離是5-7個堿基長度；ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3-4個堿基，與 AAGAA 至少相隔5 個堿基mRNA 的翻譯才能進(jìn)行；ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T 堿基豐富時，mRNA 翻譯效率較高。其次，盡量提高核糖體結(jié)合位點本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時需要注意的事項。在必要的情況下，還可通過定點突變，PCR 等技術(shù)改變個別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA 5’端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5’端序列容易形成二級結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下。再者，在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時，充分利用各個基因的結(jié)構(gòu)特征和特點，注意引入翻譯增強子序列。（2）共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因：由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變�？刹捎�1.通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子；2.在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度。（3）提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性：利用蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；對分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)；共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進(jìn)行改造；在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。（4）高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞：：大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達(dá)量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種。工程化宿主細(xì)胞：1.構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌是解決高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用的根本途徑。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值；用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷；改變代謝流的方向，通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行。2.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因編碼大腸桿RNA聚合酶的r32亞基，r32 亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。 |
4樓2013-06-20 22:01:05
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