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小科研女dow木蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白表達(dá)不出來，是什么原因造成的 已有1人參與
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各位蟲友，我之前一直在做基因文庫，好不容易從文庫中篩到了具有我要的酶活性的克隆子。但是通過測序，是一條具有好幾個(gè)閱讀框的基因片段，但是發(fā)現(xiàn)并沒有相似甚至相關(guān)的酶的基因，都是一些膜蛋白組件，還有幾個(gè)是沒有報(bào)道的未知蛋白，可是通過活性檢測，明明是有活性的。 我的做法就是，將測序結(jié)果分析閱讀框，挑了幾個(gè)較大的閱讀框（2000bp-500bp）都分別設(shè)計(jì)引物克隆表達(dá)，但是都做了4個(gè)了，都沒有表達(dá)出蛋白，是一點(diǎn)都沒有啊。 請(qǐng)問這是怎么回事？是不是不是所有的完整閱讀框都能表達(dá)蛋白，只是有功能性的蛋白可以表達(dá)？ |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法交流 |
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你是第一次做表達(dá)嗎？ 如果是，從實(shí)驗(yàn)室?guī)熜謳熃隳抢镎乙粋�(gè)確定能表達(dá)的質(zhì)粒做對(duì)照。 如果陽性對(duì)照做出來了，說明你的操作沒有問題，再考慮質(zhì)粒構(gòu)建的問題。 樓上說了一部分，你還得重點(diǎn)看你表達(dá)載體的相關(guān)文檔，看看是不是可以改進(jìn)質(zhì)粒。 我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)通過消減雜技（mRNA水平）得到一個(gè)差異基因，怎么做都表達(dá)不出蛋白，后來證實(shí)這個(gè)基因是ncRNA。你的情況應(yīng)該不屬于這類，因?yàn)槟闶菑牡鞍姿綑z測到這個(gè)基因的。多從實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面考慮問題。 |
8樓2014-08-18 18:03:55
凌波麗
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kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:47:33
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kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:47:33
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你是在原核細(xì)胞中表達(dá)？我先按照這個(gè)說，若不是你說出來，我在按照真核表達(dá)系統(tǒng)說。 克隆金銀的表達(dá)，除了需要啟動(dòng)子外，還要Shine-Dalgarno Sequence (SD序列）。Shine-Dalgarno Sequence一般位于-10及翻譯起始密碼子ATG之間，是mRNA與16SrRNA結(jié)合時(shí)所必須。Shine-Dalgarno Sequence與翻譯起始密碼子ATG之間的距離會(huì)影響基因的表達(dá)。此距離的大小與不同的啟動(dòng)子有關(guān)，一般7-9個(gè)堿基。 |
2樓2013-06-20 21:53:35
凌波麗
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3樓2013-06-20 21:59:37
凌波麗
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:49:41
kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-22 18:49:41
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高效質(zhì)粒載體表達(dá)外源基因的一般方法（原核表達(dá)系統(tǒng)）: （1）表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)：構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì) mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：SD序列 UAAGGAGG的翻譯效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是6-8個(gè)堿基長度，與 AAGAA 的最適距離是5-7個(gè)堿基長度；ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3-4個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔5 個(gè)堿基mRNA 的翻譯才能進(jìn)行；ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T 堿基豐富時(shí)，mRNA 翻譯效率較高。其次，盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng)。在必要的情況下，還可通過定點(diǎn)突變，PCR 等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA 5’端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè)SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5’端序列容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下。再者，在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，充分利用各個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列。（2）共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因：由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變�？刹捎�1.通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子；2.在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度。（3）提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性：利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)；共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造；在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。（4）高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞：：大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種。工程化宿主細(xì)胞：1.構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌是解決高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用的根本途徑。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對(duì)氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對(duì)溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值；用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷；改變代謝流的方向，通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行。2.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因編碼大腸桿RNA聚合酶的r32亞基，r32 亞基對(duì)大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。 |
4樓2013-06-20 22:01:05
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