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[求助] 我的PCR電泳圖，求高手指點(diǎn)

這張圖片是我跑的PCR電泳圖,試劑用量
dNTP:5uL,
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Mg2+:4uL.
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Enzyme(上海生工):1uL.
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1樓 2013-06-23 21:03:48

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cicelyzh

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★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
1949stone: 金幣+1, 同意 2013-06-24 07:54:08

沒有標(biāo)明各種母液的濃度和酶的種類，不好判斷濃度是否合適。還有，最好能說明模板是什么，有沒有定量？PCR產(chǎn)物的大小是多少，引物的Tm值是多少，PCR程序怎樣設(shè)置的。

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2樓2013-06-24 06:23:45

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zhaodahe

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【答案】應(yīng)助回帖

★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
1949stone: 金幣+1, 同意 2013-06-24 07:54:46
1949stone: 回帖置頂 2013-06-24 07:54:48

你的條帶不太均一，沒有marker，圖也不清楚，說不太好。不知道你用的什么酶，降低鎂離子濃度也許有幫助。另，反應(yīng)體系降到25微升試試，反應(yīng)體系小，溫度也會(huì)精確一些。

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3樓2013-06-24 07:24:54

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langduiyue

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

LZ做的單重多重PCR呀？
給體積沒用的，要具體用量，例如：引物多少pMol, 鎂離子多少 mMol
建議先查看引物如何，有無二級(jí)結(jié)構(gòu)，有無非特異位點(diǎn)，引物OK 成功一半
引物OK 做個(gè)溫度梯度，查找合適退火溫度
如效果不佳，最對(duì)試劑用量，反應(yīng)條件，做調(diào)整。

記得一定要有陽性和陰性對(duì)照

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角逐自我

4樓2013-06-24 10:57:16

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謝謝各位指點(diǎn)，dNTP:5uL,（0.25mM）
10*Buffer5uL.
Mg2+:4uL.(2mM)
Template:0.5uL.(--10ng)
Primer（F/R）:1uL.
Enzyme(上海生工Taq):1uL.(2.5u)
ddH2O:32.5uL.

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5樓2013-06-25 11:13:46

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引用回帖:

5樓: Originally posted by chunfengxiyu at 2013-06-25 11:13:46
謝謝各位指點(diǎn)，dNTP:5uL,（0.25mM）
10*Buffer5uL.
Mg2+:4uL.(2mM)
Template:0.5uL.(--10ng)
Primer（F/R）:1uL.
Enzyme(上海生工Taq):1uL.(2.5u)
ddH2O:32.5uL.

目的片段是500bp

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6樓2013-06-25 11:15:40

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7樓2013-06-25 11:18:05

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4樓: Originally posted by langduiyue at 2013-06-24 10:57:16
LZ做的單重多重PCR呀？
給體積沒用的，要具體用量，例如：引物多少pMol, 鎂離子多少 mMol
建議先查看引物如何，有無二級(jí)結(jié)構(gòu)，有無非特異位點(diǎn)，引物OK 成功一半
引物OK 做個(gè)溫度梯度，查找合適退火溫 ...

引物是老師設(shè)計(jì)好給的，直接用的，具體信息不清楚，老實(shí)說實(shí)在不行就做個(gè)T載體連接，提質(zhì)粒，再PCR，電泳。。。

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8樓2013-06-25 11:22:48

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3樓: Originally posted by zhaodahe at 2013-06-24 07:24:54
你的條帶不太均一，沒有marker，圖也不清楚，說不太好。不知道你用的什么酶，降低鎂離子濃度也許有幫助。另，反應(yīng)體系降到25微升試試，反應(yīng)體系小，溫度也會(huì)精確一些。
...

奧，最右邊的是Marker，其中比較亮的是500bp的和1000bp的

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9樓2013-06-25 11:24:21

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★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
chunfengxiyu: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-07-25 21:53:15

膠的濃度，跑膠的時(shí)間可能不太少，建議濃度大點(diǎn)，時(shí)間長點(diǎn)。mark沒跑開，，模板濃度小一點(diǎn)。。

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10樓2013-06-25 11:24:43

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