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獨(dú)孤蠶鐵桿木蟲 (著名寫手)
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熒光定量雙峰的問題
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在熒光定量實(shí)驗(yàn)過程中遇到一個(gè)問題，就是我們的家禽腿肌中提取的RNA樣品，做熒光定量經(jīng)常有雙峰，有的就沒有。不知道這個(gè)【雙峰是由于什么產(chǎn)生的】。還有，雙峰當(dāng)中我們的目的產(chǎn)物是在前峰，后峰是非特異性片段，這個(gè)我們已經(jīng)確認(rèn)過了�，F(xiàn)在的問題就是，這個(gè)【非特異的后峰對我們的定量結(jié)果有影響嗎】？之前好像聽人說過，非特異前峰對定量有影響，但后峰一般不礙事。不知道是不是這么一回事。具體的溶解曲線圖見附件。 懇請走過路過的大牛賜教一下�。� 56WKMMQT4$$Q`U9IV@)6ZTQ.jpg |
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糾正樓主一點(diǎn)：定量PCR過程中，特異性產(chǎn)物峰之后的峰絕對有影響，而且影響很大，無法消除。產(chǎn)物前鋒是可以通過調(diào)整熒光信號收集點(diǎn)的溫度來消除的。 至于樓主不同胚齡產(chǎn)物峰圖不一樣，比較認(rèn)同5樓的看法，是不是污染了DNA基因組，而且擴(kuò)曾區(qū)域剛好跨了內(nèi)含子？ 在提取RNA過程中，可以通過DNase來消化基因組DNA，同時(shí)抽提過程中注意不要吸取到非水相產(chǎn)物。 如果還是排除不了，就需要重新設(shè)計(jì)引物。 |
6樓2013-07-03 10:40:47
cicelyzh
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| 你確定后面的峰是非特異片段還是樣品RNA中污染了基因組DNA？非特異擴(kuò)增肯定會(huì)影響定量，因?yàn)槎渴峭ㄟ^熒光總量到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)目來計(jì)算的，后面的峰也會(huì)產(chǎn)生熒光，直接影響定量，而且非特異擴(kuò)增還會(huì)競爭引物，影響擴(kuò)增效率。我覺得你的這對引物問題比較大，不僅后面有峰，而且產(chǎn)物峰前面還有個(gè)小峰，很可能是引物二聚體。我認(rèn)為你需要重新設(shè)計(jì)引物。 |
3樓2013-07-02 12:29:02
獨(dú)孤蠶
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5樓2013-07-02 23:59:33
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7樓2013-07-03 11:38:15
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9樓2013-07-03 23:27:37
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10樓2013-07-04 08:26:55
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