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獨孤蠶鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
熒光定量雙峰的問題
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在熒光定量實驗過程中遇到一個問題，就是我們的家禽腿肌中提取的RNA樣品，做熒光定量經(jīng)常有雙峰，有的就沒有。不知道這個【雙峰是由于什么產(chǎn)生的】。還有，雙峰當(dāng)中我們的目的產(chǎn)物是在前峰，后峰是非特異性片段，這個我們已經(jīng)確認(rèn)過了�，F(xiàn)在的問題就是，這個【非特異的后峰對我們的定量結(jié)果有影響嗎】？之前好像聽人說過，非特異前峰對定量有影響，但后峰一般不礙事。不知道是不是這么一回事。具體的溶解曲線圖見附件。 懇請走過路過的大牛賜教一下�。� 56WKMMQT4$$Q`U9IV@)6ZTQ.jpg |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
獨孤蠶(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細(xì)的解答。 2013-07-02 12:37:20
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獨孤蠶(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細(xì)的解答。 2013-07-02 12:37:20
| 你確定后面的峰是非特異片段還是樣品RNA中污染了基因組DNA？非特異擴增肯定會影響定量，因為定量是通過熒光總量到達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù)目來計算的，后面的峰也會產(chǎn)生熒光，直接影響定量，而且非特異擴增還會競爭引物，影響擴增效率。我覺得你的這對引物問題比較大，不僅后面有峰，而且產(chǎn)物峰前面還有個小峰，很可能是引物二聚體。我認(rèn)為你需要重新設(shè)計引物。 |
3樓2013-07-02 12:29:02
尋夢377
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2樓2013-07-02 12:11:10
zhouking8758
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-04 02:58:24
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糾正樓主一點：定量PCR過程中，特異性產(chǎn)物峰之后的峰絕對有影響，而且影響很大，無法消除。產(chǎn)物前鋒是可以通過調(diào)整熒光信號收集點的溫度來消除的。 至于樓主不同胚齡產(chǎn)物峰圖不一樣，比較認(rèn)同5樓的看法，是不是污染了DNA基因組，而且擴曾區(qū)域剛好跨了內(nèi)含子？ 在提取RNA過程中，可以通過DNase來消化基因組DNA，同時抽提過程中注意不要吸取到非水相產(chǎn)物。 如果還是排除不了，就需要重新設(shè)計引物。 |
6樓2013-07-03 10:40:47
獨孤蠶
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7樓2013-07-03 11:38:15
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