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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 構建質(zhì)粒的問題
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構建質(zhì)粒的問題
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最近在構建一個質(zhì)粒，化之后總是長不出菌來。很是苦惱 具體過程是：載體是一個Amp+的質(zhì)粒，目的片段則含有kan+的抗性。目的片段用Taq plus酶P的，質(zhì)粒經(jīng)XcmI酶切后，和PCR片段一起跑電泳，然后割膠回收，回收的時候先PCR產(chǎn)物過柱，再酶切產(chǎn)物過柱，洗脫下來的產(chǎn)物取 再加入T4連接酶，4度過夜，第二天做轉化。 之前轉化都不長，昨天試了一下用單純的質(zhì)粒轉化同一批次的感受態(tài)細胞，能長出一大片菌來，所以可以排除感受態(tài)和轉化時操作有誤的問題。問題應該出在連接上，求助各位，接下來應該怎么辦？  酶切體系：dd水 27u 質(zhì)粒8u buffer 4u XcmI酶 1u 用的是NEB的 37度 水浴2小時 跑膠的時候 20u PCR產(chǎn)物+4u 溴酚藍 20u酶切產(chǎn)物+ 4u溴酚藍（2個孔，共40u酶切產(chǎn)物） 連接體系：35u洗脫下來的回收產(chǎn)物，4u buffer 1u T4連接酶 [ 來自小組 生物醫(yī)藥家族 ] |
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3樓2013-07-17 17:32:15
2樓2013-07-17 17:22:04
4樓2013-07-17 17:35:20
摩爾比要怎么算啊……能指導一下嗎？謝謝 5樓2013-07-17 18:23:08
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