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PCR引物退火溫度怎么計(jì)算？
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最近做PCR設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，引物序列為： F:CGTGCCTCCTATCCACGATTCCG R:ATTTTGCGTAATTGGGTTTGATT 引物序列和模版完全配對(duì)的，可是實(shí)驗(yàn)的時(shí)候成功率很低，每次都只能擴(kuò)增出來(lái)不多幾個(gè)樣本，引物合成報(bào)告單上正向引物的Tm值65.5度，反向引物53度，是不是因?yàn)閮蓷l引物的Tm值相差太大啊？已經(jīng)嘗試了好幾個(gè)溫度了還是擴(kuò)增效率很低？ 求高手幫忙分析哪里出問(wèn)題了，需要重新設(shè)計(jì)引物嗎，有個(gè)同學(xué)說(shuō)可以給反向引物的5'端增加幾個(gè)堿基提高一下退火溫度，這樣做可以嗎？每條引物的退火溫度怎樣單獨(dú)計(jì)算��？ |
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yimingwang
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Primer Tm Calculator在線使用。 http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ |
2樓2013-08-10 00:13:26
【答案】應(yīng)助回帖
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引物的計(jì)算方法有多種，根據(jù)其長(zhǎng)度能夠選擇多種計(jì)算方法。你的引物兩條引物的GC含量差異很大，必須要遷就反向引物，這樣的退火溫度不好設(shè)定�？梢試L試給反向引物增加堿基以提高Tm值，將反向以引物的Tm提高到接近正向引物，退火溫度在58-60左右再試試。 關(guān)于計(jì)算，可以借助設(shè)計(jì)惹軟件。提供一文章做參考：解鏈溫度( Tm) 不同預(yù)測(cè)方法的比較 張艷春，屈武斌，盧一鳴，周 揚(yáng)，張成崗 |
3樓2013-08-11 08:40:26
amareyue
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