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下雨了嗎__鐵桿木蟲 (小有名氣)
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[求助]
離子交換蛋白純化
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| 我做蛋白純化，采用的是SP離子交換，采用線性洗脫，一般蛋白在洗脫液6-15%的時候出峰，但后來我配溶液用的pH計有些不準了，所以配的沖平緩沖液和洗脫液pH均有些不準，然后做AKTA，在上述區(qū)間出了極小的峰（取名峰1,2,3），洗脫液升到17%左右時（一般這種情況就不會再出目標峰了）我就將洗脫液調(diào)至100%，洗雜蛋白，結果出了很高的峰（峰4），而且電泳結果顯示，峰1,2,3,4均含目標蛋白。問：a:為什么線性洗脫時目標峰總是出好幾個峰呢，以前的也是，怎樣才能讓它變成一個峰呢，跟我的洗脫方式有關嗎？b：峰4按以前是沒有目標蛋白的，但這次含量很高，是我的緩沖液pH改變了，所以出峰的位置改變，可能大于17%了？還是我的柱子出了問題呢？請高手指教 |
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5樓2013-08-27 08:27:22
【答案】應助回帖
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a. 蛋白表達后的修飾不一定一樣的，舉個例子，同一蛋白，部分可能被磷酸化，部分沒有，表面電荷就會不一樣的等等。。。同一蛋白在線性洗脫下出現(xiàn)幾個峰是很正常的，尤其是線性時間長，填料分辨率高的情況下。尤其是做蛋白結晶的，更需要把不同修飾的同一蛋白分開，才能盡量保證蛋白的均一性，有利于晶體形成。 希望出現(xiàn)同一峰的話，你直接30%洗脫，肯定就只有一個峰，或者換換分辨率比較低的柱子，再或者減少線性洗脫的時間，基本上都可以得到一個峰。 b. PH改變了一般會影響出峰時間的，所以PH計每次用前最好校準，如果你懶得校準，你可以直接測一下校準液看看PH是否有區(qū)別，如果有再校準，沒有的話就可以使用了。 |
6樓2013-08-27 10:00:58
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