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下雨了嗎__鐵桿木蟲 (小有名氣)
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[求助]
離子交換蛋白純化
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| 我做蛋白純化，采用的是SP離子交換，采用線性洗脫，一般蛋白在洗脫液6-15%的時(shí)候出峰，但后來我配溶液用的pH計(jì)有些不準(zhǔn)了，所以配的沖平緩沖液和洗脫液pH均有些不準(zhǔn)，然后做AKTA，在上述區(qū)間出了極小的峰（取名峰1,2,3），洗脫液升到17%左右時(shí)（一般這種情況就不會(huì)再出目標(biāo)峰了）我就將洗脫液調(diào)至100%，洗雜蛋白，結(jié)果出了很高的峰（峰4），而且電泳結(jié)果顯示，峰1,2,3,4均含目標(biāo)蛋白。問：a:為什么線性洗脫時(shí)目標(biāo)峰總是出好幾個(gè)峰呢，以前的也是，怎樣才能讓它變成一個(gè)峰呢，跟我的洗脫方式有關(guān)嗎？b：峰4按以前是沒有目標(biāo)蛋白的，但這次含量很高，是我的緩沖液pH改變了，所以出峰的位置改變，可能大于17%了？還是我的柱子出了問題呢？請(qǐng)高手指教 |
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wolfman840
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1.你的目標(biāo)蛋白的帶電情況和分子量不一致，正常處于一個(gè)范圍內(nèi)，因此做線性洗脫時(shí)會(huì)有幾個(gè)不一樣的峰出來，尤其是當(dāng)你的填料顆粒比較細(xì)小和均勻的時(shí)候。 2.這次你pH不對(duì)，其實(shí)你應(yīng)該有目的的延長一下線性洗脫的梯度，既然知道問題所在，再進(jìn)行一個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證一下就可以了。 3.柱子只要在正確的條件下出峰情況一致就沒有壞，及時(shí)用清洗液清洗再生，保護(hù)好柱子。 |
2樓2013-08-26 12:23:01
wangchclove
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3樓2013-08-26 20:24:24
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4樓2013-08-27 08:26:08
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5樓2013-08-27 08:27:22
【答案】應(yīng)助回帖
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a. 蛋白表達(dá)后的修飾不一定一樣的，舉個(gè)例子，同一蛋白，部分可能被磷酸化，部分沒有，表面電荷就會(huì)不一樣的等等。。。同一蛋白在線性洗脫下出現(xiàn)幾個(gè)峰是很正常的，尤其是線性時(shí)間長，填料分辨率高的情況下。尤其是做蛋白結(jié)晶的，更需要把不同修飾的同一蛋白分開，才能盡量保證蛋白的均一性，有利于晶體形成。 希望出現(xiàn)同一峰的話，你直接30%洗脫，肯定就只有一個(gè)峰，或者換換分辨率比較低的柱子，再或者減少線性洗脫的時(shí)間，基本上都可以得到一個(gè)峰。 b. PH改變了一般會(huì)影響出峰時(shí)間的，所以PH計(jì)每次用前最好校準(zhǔn)，如果你懶得校準(zhǔn)，你可以直接測一下校準(zhǔn)液看看PH是否有區(qū)別，如果有再校準(zhǔn)，沒有的話就可以使用了。 |
6樓2013-08-27 10:00:58
joux19
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9樓2014-10-13 10:38:19
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