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[求助]
【求助】 SDS-PAGE
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電泳結(jié)果一直是只有兩三個個條帶可見，跑的是斑馬魚勻漿，用的是勻漿管手動勻漿，用的PBS做勻漿介質(zhì)，同一塊膠跑的小鼠肝臟勻漿條帶很多。希望大家?guī)兔Ψ治鱿略�，是不是樣品提取的問題。提取的蛋白量不夠？ DSC01062.JPG |
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2樓2013-08-26 21:22:32
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.好像電泳帶的拖尾比較嚴(yán)重。樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑（表面活性劑增容）；電泳緩沖液時間可能過長。 2.蛋白質(zhì)樣品是否存在降解？或者樣品純化時丟失了不少蛋白質(zhì)。包括未使用樣品促溶劑（表面活性劑增容）導(dǎo)致了蛋白質(zhì)樣品丟失； 3.樣品也似未濃縮好。應(yīng)適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓。 4.緩沖溶液是不是有問題？或者防止太久。 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進行；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 |
3樓2013-08-26 23:34:53
ritchiejin
銅蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
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ufowjing: 金幣+5, ★★★★★最佳答案 2013-08-27 18:52:53
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首先，小鼠肝臟勻漿中的雜質(zhì)（如脂類，多糖等）要比整條的斑馬魚少得多。所以，同樣的處理方法，在斑馬魚蛋白提取中效果會不好。 其次，蛋白條帶拖尾和彌散也同樣是因為雜質(zhì)沒有去除干凈。但是從marker的條帶看，膠應(yīng)該沒有大的問題。 動物全蛋白提取的話，個人認(rèn)為只用PBS是不夠的，PBS的pH緩沖范圍有限，有些蛋白不容易溶解進入，可能隨著你離心就沉淀下來了。建議你能使用丙酮沉淀法，既能除去大部分雜質(zhì)，也能夠除鹽。雖然一些蛋白可能會丟失，但是會比PBS勻漿的方法提取的蛋白要多。另外，我們提蛋白都是用液氮冷凍研缽研磨，再加入蛋白裂解液超聲的。你可以試一試。 |
4樓2013-08-27 10:05:09
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謝謝您的解答，我看到一個方法是說： 肝每50mg加（裂解液）0.5mlRIPA和5uLPMSF（不能預(yù)先加入，否則失效） 手動或電動勻漿。注意保持低溫（埋在冰中），快速勻漿。 將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，12000g離心，4℃，2-3min。 是按照這種操作步驟嗎？那是否還需要PBS？ 裂解液是用RIPA裂解液嗎？是自己配置的還是買現(xiàn)成的效果會好一點？如果買買哪個牌子的好一點？還有PMSF是買哪個品牌的好一點？ 能給我發(fā)一下你們平常實驗的具體實驗步驟嗎？ 像PMSF、裂解液的濃度和每mg肝臟的用量， 超聲的條件設(shè)置，從南京建成給的實驗方法學(xué)看到的可以用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀400安培，5秒/次，間歇反復(fù)3-5次。這樣操作可以嗎？ 剛接觸電泳實驗，不懂的很多問題有點多，麻煩您解答一下  |
5樓2013-08-27 18:52:07
6樓2013-08-27 18:58:21
ritchiejin
銅蟲 (初入文壇)
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我在百度百科上查了RIPA裂解液的說明，RIPA主要是從動物組織和動物細(xì)胞中抽取的可溶性蛋白的。那么脂溶性蛋白很有可能就丟失了。但是每種提取蛋白的方法都有優(yōu)劣，也都會丟失部分蛋白。如果條件允許，你可以都嘗試一下，確定你所關(guān)注的差異點可能存在于膠圖的哪一段pH值內(nèi)，進而選擇針對這段pH值的蛋白提取的方法（如酸性區(qū)域蛋白或堿性區(qū)域蛋白）。商業(yè)化的裂解液我個人認(rèn)為都一樣是配出來的，只要自己選用進口的試劑，嚴(yán)格的操作，質(zhì)量不會比他們差。我們的裂解液都是自己配的，PMSF用的是sigma的。超聲的話，我們是400W，2s超聲+6s間隔，冰浴，因為我們用的是1.5mlEP管裝的，體積小，所以很害怕超聲的時候發(fā)熱，蛋白變性。 |
7樓2013-08-28 14:55:24
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