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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 求助抗體的蛋白濃度檢測方法
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求助抗體的蛋白濃度檢測方法
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最近從millipore買了人IgM，說明書上寫的濃度是1.6mg/ml，到貨后我立即取了幾ul做了蛋白定量。實驗室一直用的是Bradford法做標準曲線做蛋白定量，之前表達的蛋白也都是用這個方法來測的。結果測得的結果吸光度幾乎為0.反復測了幾次，從多管里取樣本來檢測都是這個結果。后來在網(wǎng)上查到IgM有個測280nm的公式，濃度=A280/1.18,如果按這個公式來算的話又是和說明書相符的。到底是什么原因呢？ 同時拿自己純化的兔IgG做了Bradford蛋白定量是4.4mg/ml，如果按A280、A260的公式：濃度=1.45A280-0.74A260來算的話，就到了20mg/ml，這也太假了點。 這又是什么原因呢？？ 求助各位！謝啦 |
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hl16010921
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
claire8168(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵交流 2013-09-13 09:31:02
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claire8168(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵交流 2013-09-13 09:31:02
| 1.考染法蛋白定量受表面活性劑的濃度影響很大，而抗體保存液中可能含有表面活性劑。2.考染法的靈敏度也不是特別高，檢測濃度下限達到25μg/ml，用100ul檢測體積，就需2.5ug樣品。而一般抗體的總量才100ug左右，你測試的用量已經(jīng)低于或接近檢出限了，所以偏差會比較大。3.該抗體生產(chǎn)時的定量方法應該是測280nm的吸收。所以280吸收法測得相符。4.有時大家不測濃度直接做下面的實驗，因為抗體的效價差異大多數(shù)時候大于濃度差異。5.電泳法有時是好的辦法，而且可以看到樣品的純度，有無雜蛋白。（抗體用ddt或巰基乙醇會輕重鏈分開，切記） |
2樓2013-09-13 09:21:29
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謝謝您給的建議，因為我測蛋白濃度是需要做抗體的交聯(lián)，交聯(lián)劑加入時是需要計算摩爾比的，所以效價需要測，濃度也需要測。個人覺得280 260算抗體濃度只是一個粗略的結果，其靈敏度應該是低于Bradford法的，并且查閱相關信息后發(fā)現(xiàn)bradford法檢測蛋白濃度的優(yōu)勢就是其靈敏度和 不受蛋白溶液中某些溶劑的影響。所以按理說bradford法的檢測應該更準確。 還有購買的IgM說明書中寫就是溶在了PBS+疊氮鈉里，難道疊氮鈉會影響其檢測？ 我的IgG也只是溶在了PBS里，所以更不應該存在什么干擾檢測的物質了。電泳確實是一個比較好的辦法，我也在想實在解決不了就只能跑SDS-PAGE了，但其只能半定量的得到大概估計的一個濃度，還是沒辦法做到確定的得到一個具體的數(shù)值。 |
3樓2013-09-13 09:42:47
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1.你可以在電泳中多設幾個標準蛋白的濃度孔，然后照相用軟件定量，建一條標準曲線，估計精度會好很多。2.估計抗體溶液里還有其他成分。3.280法是很粗糙的方法了。如果一定要用Bradford法的話，就延長時間。時間對考染法影響比較大。試試更長時間。4.可以試試BCA法，考染法怕表面活性劑，BCA法怕還原劑。5.交聯(lián)反應不可能是完全反應的，因此摩爾比不一定關鍵。6.文章發(fā)表時，商業(yè)化試劑的原始濃度是被認可的，而LZ自己標定的蛋白濃度是被懷疑的（需提供證據(jù)證明）因此標定這個濃度可能只在自己試驗時有意義，發(fā)文章還的改成抗體標定的濃度，否則遇到叫真的審稿人也是麻煩。 |
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claire81684樓2013-09-13 10:27:22
5樓2013-09-13 10:53:44
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