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claire8168鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
求助抗體的蛋白濃度檢測(cè)方法
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最近從millipore買了人IgM，說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)的濃度是1.6mg/ml，到貨后我立即取了幾u(yù)l做了蛋白定量。實(shí)驗(yàn)室一直用的是Bradford法做標(biāo)準(zhǔn)曲線做蛋白定量，之前表達(dá)的蛋白也都是用這個(gè)方法來(lái)測(cè)的。結(jié)果測(cè)得的結(jié)果吸光度幾乎為0.反復(fù)測(cè)了幾次，從多管里取樣本來(lái)檢測(cè)都是這個(gè)結(jié)果。后來(lái)在網(wǎng)上查到IgM有個(gè)測(cè)280nm的公式，濃度=A280/1.18,如果按這個(gè)公式來(lái)算的話又是和說(shuō)明書(shū)相符的。到底是什么原因呢？ 同時(shí)拿自己純化的兔IgG做了Bradford蛋白定量是4.4mg/ml，如果按A280、A260的公式：濃度=1.45A280-0.74A260來(lái)算的話，就到了20mg/ml，這也太假了點(diǎn)。 這又是什么原因呢？？ 求助各位！謝啦 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
claire8168(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2013-09-13 09:31:02
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claire8168(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2013-09-13 09:31:02
| 1.考染法蛋白定量受表面活性劑的濃度影響很大，而抗體保存液中可能含有表面活性劑。2.考染法的靈敏度也不是特別高，檢測(cè)濃度下限達(dá)到25μg/ml，用100ul檢測(cè)體積，就需2.5ug樣品。而一般抗體的總量才100ug左右，你測(cè)試的用量已經(jīng)低于或接近檢出限了，所以偏差會(huì)比較大。3.該抗體生產(chǎn)時(shí)的定量方法應(yīng)該是測(cè)280nm的吸收。所以280吸收法測(cè)得相符。4.有時(shí)大家不測(cè)濃度直接做下面的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榭贵w的效價(jià)差異大多數(shù)時(shí)候大于濃度差異。5.電泳法有時(shí)是好的辦法，而且可以看到樣品的純度，有無(wú)雜蛋白。（抗體用ddt或巰基乙醇會(huì)輕重鏈分開(kāi)，切記） |
2樓2013-09-13 09:21:29
claire8168
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謝謝您給的建議，因?yàn)槲覝y(cè)蛋白濃度是需要做抗體的交聯(lián)，交聯(lián)劑加入時(shí)是需要計(jì)算摩爾比的，所以效價(jià)需要測(cè)，濃度也需要測(cè)。個(gè)人覺(jué)得280 260算抗體濃度只是一個(gè)粗略的結(jié)果，其靈敏度應(yīng)該是低于Bradford法的，并且查閱相關(guān)信息后發(fā)現(xiàn)bradford法檢測(cè)蛋白濃度的優(yōu)勢(shì)就是其靈敏度和 不受蛋白溶液中某些溶劑的影響。所以按理說(shuō)bradford法的檢測(cè)應(yīng)該更準(zhǔn)確。 還有購(gòu)買的IgM說(shuō)明書(shū)中寫(xiě)就是溶在了PBS+疊氮鈉里，難道疊氮鈉會(huì)影響其檢測(cè)？ 我的IgG也只是溶在了PBS里，所以更不應(yīng)該存在什么干擾檢測(cè)的物質(zhì)了。電泳確實(shí)是一個(gè)比較好的辦法，我也在想實(shí)在解決不了就只能跑SDS-PAGE了，但其只能半定量的得到大概估計(jì)的一個(gè)濃度，還是沒(méi)辦法做到確定的得到一個(gè)具體的數(shù)值。 |
3樓2013-09-13 09:42:47
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1.你可以在電泳中多設(shè)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度孔，然后照相用軟件定量，建一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，估計(jì)精度會(huì)好很多。2.估計(jì)抗體溶液里還有其他成分。3.280法是很粗糙的方法了。如果一定要用Bradford法的話，就延長(zhǎng)時(shí)間。時(shí)間對(duì)考染法影響比較大。試試更長(zhǎng)時(shí)間。4.可以試試BCA法，考染法怕表面活性劑，BCA法怕還原劑。5.交聯(lián)反應(yīng)不可能是完全反應(yīng)的，因此摩爾比不一定關(guān)鍵。6.文章發(fā)表時(shí)，商業(yè)化試劑的原始濃度是被認(rèn)可的，而LZ自己標(biāo)定的蛋白濃度是被懷疑的（需提供證據(jù)證明）因此標(biāo)定這個(gè)濃度可能只在自己試驗(yàn)時(shí)有意義，發(fā)文章還的改成抗體標(biāo)定的濃度，否則遇到叫真的審稿人也是麻煩。 |
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claire81684樓2013-09-13 10:27:22
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5樓2013-09-13 10:53:44
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