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折磨了一個(gè)月的測(cè)序-重疊峰問題!
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我最近的實(shí)驗(yàn)是根據(jù)別人文獻(xiàn)報(bào)道的引物,P四株細(xì)菌中可能存在的一個(gè)基因。經(jīng)過摸索退火溫度,我已經(jīng)可以P出單一條帶,然后我就把PCR產(chǎn)物直接拿去測(cè)序,均顯示重疊峰嚴(yán)重,結(jié)果為雜合,比對(duì)的基因相似也很低。然后我又做了一次重復(fù),條帶很單一,很亮,又直接拿去測(cè)序,結(jié)果相同。 所以這周我選擇克隆測(cè)序,回收片段,連接載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,挑陽性克隆培養(yǎng),在將菌液拿去測(cè)序前,我也用引物進(jìn)行了陽性克隆鑒定,結(jié)果條帶仍舊很單一。 但是今天的測(cè)序結(jié)果出來后顯示,所有結(jié)果均為非單一克隆,其測(cè)序的套峰仍舊很嚴(yán)重! 現(xiàn)在我很迷茫,不知道這是為什么,心情也很沮喪,還請(qǐng)大家多多幫助! |
金蟲 (小有名氣)

金蟲 (小有名氣)

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