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doubleping新蟲 (小有名氣)
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[求助]
虐心的PCR-DGGE
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實驗做得我快絕望了！�。�！ 我是做土壤微生物群落，先提取了土壤中的DNA，呈黃棕色，經(jīng)過稀釋不同倍數(shù)之后擴增出了16S，然后擴增了V3區(qū)，但是有非特異性條帶，接著用V3產(chǎn)物去跑DGGE，62℃，20V，10min預(yù)跑，然后是62℃，7H，120V，一直在調(diào)試最好的梯度，剛調(diào)試到梯度47%-62%的時候，感覺條帶還是有點靠下面，想再試試50%-60%。。。。。�？墒潜瘎【蛠砹耍谷灰粭l條帶都沒有跑出來，或者有時候有一塊膠有條帶有一塊沒有條帶，（我用的是緩沖液7L的bio-rad的DGGE，可以同時跑兩塊膠）但是我點的DL2000都有跑出來，真讓我郁悶�。�！我以為是樣品問題，但是同樣的樣品檢測有亮帶，還有一次竟然同樣的樣品第二次DGGE有條帶還很多。 想重新擴增樣品，可是這兩天本來可以全部擴增出來的樣品現(xiàn)在16S竟然有一半擴不出來，16S產(chǎn)物全部擴不出V3區(qū)，想不出什么道理！ 有16S可以擴出來，酶和16S引物應(yīng)該是沒有問題的，V3的引物是剛稀釋的可能有問題，其他我就想不出來了，各位大俠幫我找找原因吧 我的體系，16S和V3區(qū)一樣都是30ul， 2*taq mastermix 15ul 引物各 1ul 模板 1ul ddH2O 12ul 16S程序：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min；30循環(huán)；72℃ 10min。 V3區(qū)程序：touchdown DGGE膠：47%-62% 47%：100%變性劑 9.4ml+0%變性劑 10.6ml+80ul APS+10ul TEMED 62%:100%變性劑 12.4ml+0%變性劑 7.6ml+80ul APS+10ul TEMED |
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 | 環(huán)境微生物 | dgge |
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7樓2013-09-22 21:29:59
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2013-09-22 11:51:42
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首先你的DNA是不是有問題； 再來PCR引物是不是多了點，P不出來的原因太多，這個要你自己慢慢找原因了； 最后DGGE，感覺你做的比較亂，先說做膠，因為我們通常做的梯度大多不超過70%，所以你可以配一個70%和0%的變性劑，再來配相應(yīng)的梯度，這樣可使控制一下誤差，不然每次做膠的梯度誤差太大；還有梯度不需要這么精確，差不多就可以。電泳的時間和電壓你可以參照別人的先跑，再自己調(diào)整，剛開始電壓大一點，我都是先200V，5min之后再接著跑的。 |
3樓2013-09-22 08:54:20
doubleping
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4樓2013-09-22 09:42:02
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