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doubleping新蟲 (小有名氣)
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[求助]
虐心的PCR-DGGE
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實(shí)驗(yàn)做得我快絕望了�。。�！ 我是做土壤微生物群落，先提取了土壤中的DNA，呈黃棕色，經(jīng)過稀釋不同倍數(shù)之后擴(kuò)增出了16S，然后擴(kuò)增了V3區(qū)，但是有非特異性條帶，接著用V3產(chǎn)物去跑DGGE，62℃，20V，10min預(yù)跑，然后是62℃，7H，120V，一直在調(diào)試最好的梯度，剛調(diào)試到梯度47%-62%的時候，感覺條帶還是有點(diǎn)靠下面，想再試試50%-60%。。。。。。可是悲劇就來了，竟然一條條帶都沒有跑出來，或者有時候有一塊膠有條帶有一塊沒有條帶，（我用的是緩沖液7L的bio-rad的DGGE，可以同時跑兩塊膠）但是我點(diǎn)的DL2000都有跑出來，真讓我郁悶�。。∥乙詾槭菢悠穯栴}，但是同樣的樣品檢測有亮帶，還有一次竟然同樣的樣品第二次DGGE有條帶還很多。 想重新擴(kuò)增樣品，可是這兩天本來可以全部擴(kuò)增出來的樣品現(xiàn)在16S竟然有一半擴(kuò)不出來，16S產(chǎn)物全部擴(kuò)不出V3區(qū)，想不出什么道理！ 有16S可以擴(kuò)出來，酶和16S引物應(yīng)該是沒有問題的，V3的引物是剛稀釋的可能有問題，其他我就想不出來了，各位大俠幫我找找原因吧 我的體系，16S和V3區(qū)一樣都是30ul， 2*taq mastermix 15ul 引物各 1ul 模板 1ul ddH2O 12ul 16S程序：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min；30循環(huán)；72℃ 10min。 V3區(qū)程序：touchdown DGGE膠：47%-62% 47%：100%變性劑 9.4ml+0%變性劑 10.6ml+80ul APS+10ul TEMED 62%:100%變性劑 12.4ml+0%變性劑 7.6ml+80ul APS+10ul TEMED |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 環(huán)境微生物 | dgge |
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凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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P樓主的情況可能是：PCR擴(kuò)增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 2013年9月5日 PCR擴(kuò)增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶，其原因與對策如下：一．引物的特異性差，受非特異性的PCR擴(kuò)增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴(kuò)增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少。可能的具體原因和對策如下： 設(shè)立陽性和陰性對照，檢查反應(yīng)體系是否被污染。如果被污染則采用相應(yīng)的對策消除污染。具體見“二”。 加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性。 3.Taq DNA聚合酶的專一性擴(kuò)增不夠。改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 3.縮短退火溫度時間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計(jì)引物，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴(kuò)增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度降低1-3度。 4.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動PCR和巢式PCR。 使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，非特異性擴(kuò)增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 使用熱啟動模式�？梢再徺I商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。 二．反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 1.整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決：（1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。（2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。（3）所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。對策：實(shí)驗(yàn)前對實(shí)驗(yàn)室充分通風(fēng)，試驗(yàn)時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間，還可用巢式PCR方法來減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 前面所有措施都不行，那就只好重新設(shè)引物了。本文是2013年9月5日早晨我剛剛重新寫的。 |
9樓2013-09-22 22:09:06
2樓2013-09-22 07:57:45
lhf903
金蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2013-09-22 11:51:42
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2013-09-22 11:51:42
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首先你的DNA是不是有問題； 再來PCR引物是不是多了點(diǎn)，P不出來的原因太多，這個要你自己慢慢找原因了； 最后DGGE，感覺你做的比較亂，先說做膠，因?yàn)槲覀兺ǔＷ龅奶荻却蠖嗖怀^70%，所以你可以配一個70%和0%的變性劑，再來配相應(yīng)的梯度，這樣可使控制一下誤差，不然每次做膠的梯度誤差太大；還有梯度不需要這么精確，差不多就可以。電泳的時間和電壓你可以參照別人的先跑，再自己調(diào)整，剛開始電壓大一點(diǎn)，我都是先200V，5min之后再接著跑的。 |
3樓2013-09-22 08:54:20
doubleping
新蟲 (小有名氣)
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4樓2013-09-22 09:42:02
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