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blairwang新蟲 (初入文壇)
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[求助]
長(zhǎng)片段PCR 求助！
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| 第一次做long PCR，用的是 QIAGEN 的 LongRange PCR Kit，號(hào)稱最長(zhǎng)能擴(kuò)到40K。我不管，一上來(lái)就分別針對(duì)16K、29K、34K和39K的區(qū)域設(shè)計(jì)了四對(duì)引物，引物平均長(zhǎng)度25b，Tm 68°左右。其中29K和39K的兩對(duì)引物，primer blast 的結(jié)果特異性較好，另外兩個(gè)不太好。前后做了兩次PCR，退火溫度為62°和63°，跑了24 hours 以上，對(duì)mg2+、模板、高GC buffer 都進(jìn)行了梯度實(shí)驗(yàn)，最后出來(lái)跑膠都沒(méi)有結(jié)果，除了幾個(gè)較暗的大范圍彌散條帶。請(qǐng)問(wèn)大家，還有什么因素是我遺漏的，還是說(shuō)引物設(shè)計(jì)的不好。。。 |
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gufeng2008
金蟲 (小有名氣)
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2樓2013-12-04 11:04:11
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