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1989zb金蟲 (小有名氣)
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[求助]
怎么做融合蛋白？
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現(xiàn)在準(zhǔn)備做一個(gè)融合蛋白，有兩種方法不知道該用哪種好呢？ 第一種：通過去掉第一個(gè)蛋白的終止子，用linker連接第二個(gè)蛋白，不知道怎么選擇linker? 第二種：通過融合PCR 擴(kuò)增出兩個(gè)蛋白的基因全長(zhǎng) ，第一個(gè)蛋白的基因序列也去掉終止子， 請(qǐng)問這兩種方法哪種更好點(diǎn)呢？？？ 還有就是怎么設(shè)計(jì)linker呢？ |
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1989zb
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【答案】應(yīng)助回帖
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1989zb: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-10-13 09:36:51
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構(gòu)建融合蛋白的基本原則是， 將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共同表達(dá)。具體步驟有： 1.進(jìn)行目的基因的克�。焊鶕�(jù)基因序列互補(bǔ)原則 ，設(shè)計(jì)合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的目的DNA片段。 2.在載體中進(jìn)行重組：通過限制內(nèi)切酶將兩個(gè)DNA片段進(jìn)行酶切并回收，然后通過連接酶將兩個(gè)具有相同末端酶切位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行體外連接，并克隆到高表達(dá)質(zhì)粒載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。 3.將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并利用選擇標(biāo)志進(jìn)行篩選及測(cè)序。 4.融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化 。 |
3樓2013-10-13 07:46:23
1989zb
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4樓2013-10-13 09:36:40
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