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dingcong1216新蟲 (小有名氣)
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[求助]
急！3‘race 反轉(zhuǎn)錄程序
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第一次做3‘race，師兄告訴我3’race反轉(zhuǎn)錄體系是： 5×PrimeScript Buffer(for Real Time) 2μL PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL 3'Race aptor 1 μL Total RNA RNase Free dH2O up to 10μL 可是不知道反轉(zhuǎn)錄程序是什么，是普通的反轉(zhuǎn)錄程序 37度 15min 85度 5S 4度 還是42度 60min 70 度 15min |
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 RACE |
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dingcong1216
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● 使用實(shí)驗(yàn)樣品 RNA 時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作方法1. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下： ◆ 反應(yīng)體系: 試劑 使用量 RNA* X μl* 3′ RACE Adaptor（5 μM） 1 μl 5×PrimeScript Buffer 2 μl dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.25 μl PrimeScript RTase（200 U/μl） 0.25 μl RNase Free dH2O 5.5-X μl Total Volume 10 μl* 一般情況下，Total RNA的使用量為1 μg，Poly(A)+RNA的使用量為50 ng。增加模板RNA的使用量有時(shí)會(huì)使反應(yīng)性能下降，不建議使用大于1 μg的Total RNA。 ◆ 反應(yīng)條件* 42℃, 60 min↓ 70℃, 15 min 反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或?qū)⒎磻?yīng)液保存于-20℃。* 對(duì)于立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因，可以先將 RNA 變性后再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。具體操作為：首先將 RNA和引物的混合物 70℃變性 10 分鐘，冰上急冷，然后再加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的其余試劑，進(jìn)行 42℃、60 分鐘的延伸反應(yīng)。 |
5樓2013-10-20 16:38:43
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