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細(xì)菌V3區(qū)擴(kuò)增
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RT..最近做的細(xì)菌V3區(qū)擴(kuò)增想做下DGGE，但是非特異性條帶一直很多，退火溫度調(diào)節(jié)了好幾次還是沒(méi)很好的改善。能否請(qǐng)各位看下幫我解決一下 體系如下 2xmix 25ul 338F 1ul 518R 1ul 模板 1ul ddH2O 補(bǔ)足 50ul (模板為16S 的產(chǎn)物） 程序 94℃ 5 min 94℃ 5 min 65℃（-0.5℃）0.5 min 20cycle（第2-4步） 72℃ 3 min 94℃ 1 min 55℃ 0.5min 10cycle（第5-7步） 72℃ 3 min 72℃ 10min 在下比較著急啊 請(qǐng)各位幫幫忙。。 ${{RQUFR(I4VCIF]E}Y{U~2.jpg |
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木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lance-tan: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-11-05 13:11:50
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2013-11-05 12:30:18, 49 K
4樓2013-11-05 12:30:20
zqp9110
金蟲 (正式寫手)
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額，問(wèn)題貌似還挺多 1.PCR反應(yīng)各步驟的時(shí)間不需要那么長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間94℃對(duì)聚合酶活性有影響，V3區(qū)一共就150多bp，延伸時(shí)間30s足夠。 2.環(huán)境樣本用touchdown沒(méi)錯(cuò)，但總體循環(huán)數(shù)可少一些，比如20個(gè)循環(huán)，可減少非特異。 3.建議上DGGE之前做一次re-conditioning PCR，對(duì)DGGE效果幫助很大。 4. 貌似你用的是巢式PCR？第一步16S全長(zhǎng)的產(chǎn)物作為第二步V3擴(kuò)增的模板？這樣的話模板需要稀釋100倍左右，不然量太大，會(huì)增加非特異。為何不嘗試直接擴(kuò)增V3區(qū)？ |
8樓2013-11-06 00:16:27
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