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lipingzhou銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
RT-PCR電泳結(jié)果各位幫忙看看是什么原因
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| 大家?guī)臀铱纯碦T-PCR電泳結(jié)果，我該怎么辦，走投無路了。首尾是marker100-600bp的，第一部分的4個孔是324bp的，現(xiàn)在卻P成分子量好大的；第二部分4個孔是263bp的，隱約可見；第三部分4個孔是360bp的，最后4個孔是內(nèi)參318bp的，幾乎沒有。每個泳道下面都有糊狀，怎么會這樣，我該怎么改進？ 我的PCR條件是94度3min后94度30s，56度30s，72度45s，30個循環(huán)，72度5min。怎么改進？ |
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2013-11-19 16:05:51, 246.1 K
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lipingzhou
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5樓2013-11-20 13:48:36
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3樓2013-11-20 13:13:18
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【答案】應(yīng)助回帖
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你的引物濃度已經(jīng)很低了，一般終濃度在0.1-0.5μM。引物是自己設(shè)計的？是否優(yōu)化過PCR條件？做RT樣品前，可以先用gDNA摸索一下引物擴增的最優(yōu)條件。 用cDNA為模板PCR時循環(huán)數(shù)目要根據(jù)目標基因的表達豐度來定。你做RT-PCR的目的是擴增出cDNA片段，還是要定量？如果只是要P出目標基因就比較簡單，只需先做一個預(yù)實驗，然后調(diào)整循環(huán)數(shù)目和模板多少就可以比較理想地擴增出目標條帶。如果要定量，需要在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上做不同循環(huán)數(shù)目確定樣品擴增出來的條帶未到飽和，這樣才有定量的意義。 你的擴增效果不好可能還與樣品有關(guān)。你的RNA提得怎么樣，用的是總RNA還是mRNA反轉(zhuǎn)錄的？RNA樣品反轉(zhuǎn)錄前消化DNA是否完全？ 做真核樣品的RT-PCR在引物設(shè)計時一般會選擇跨越內(nèi)含子，這樣可以區(qū)分條帶是由gDNA擴增出來的還是cDNA擴增出來的。 |
4樓2013-11-20 13:34:02
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