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garonne

銅蟲 (小有名氣)

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[求助] 一直擴(kuò)增不了目標(biāo)產(chǎn)物，求助

求助各位大俠，本人開始課題已經(jīng)8個月了，一直得不到目的基因，請各位給點建議，多謝了。
先介紹一下我的課題，我要擴(kuò)增的是蝦夷扇貝的一個基因，目前在NCBI數(shù)據(jù)庫中只能找到海灣扇貝的這個基因，沒有其他扇貝數(shù)據(jù)。
用海灣扇貝，牡蠣，蛤類，貽貝等貝類設(shè)計不出引物，如果設(shè)計兼并引物的話簡并度很高，20bp的引物至少需要6個位置兼并，剔除海灣扇貝后設(shè)計了很多引物，都擴(kuò)增不了。后來把海灣扇貝加進(jìn)去，只能設(shè)計一個兼并引物，用這個兼并引物的正向和反向引物和marathon 試劑盒的AP1一起擴(kuò)增（cDNA是marathon cDNA），得到的條帶很弱，切下條帶后用同樣的引物做二次PCR，得到很亮的條帶，切膠回收后subcloning，挑了很多菌落測序，得到的序列能夠找到目標(biāo)引物和AP1，但把這個序列blastn后卻沒有相似性。
我很懷疑我得到的序列是不是目的基因，到底是新序列還是非特異性擴(kuò)增，該如何確認(rèn)？
我擴(kuò)增了這么久，得不到目的產(chǎn)物，也很難找到靠譜的引物，該如何改進(jìn)策略，從蛋白入手還是建phage cDNA文庫，建了文庫后如果用海灣扇貝的cDNA抗體來篩選把握大不大？
該如何預(yù)判我的目標(biāo)基因到底在蝦夷扇貝中表達(dá)不表達(dá)？是不是我的目標(biāo)產(chǎn)物根本不表達(dá)（從文獻(xiàn)中看各種物種都普遍表達(dá)）？

請各位高手給點建議，多謝了。

[ Last edited by garonne on 2013-11-26 at 14:50 ]

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1樓 2013-11-26 14:48:47

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