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飄雪3889木蟲 (小有名氣)
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[求助]
RT-PCR反應中模板DNA的問題 已有1人參與
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| 我做RT-PCR，買的是Introvigen的試劑盒進行總RNA提取、逆轉錄成cDNA第一鏈、再PCR。以cDNA第一鏈作為模板進行PCR。今天有人指出，PCR是要用雙鏈DNA為模板，而cDNA是單鏈，以單鏈為模板弄是錯誤的。而我看書上說RT-PCR是傳統(tǒng)PCR的拓展，就是以cDNAA第一鏈作為模板的，合成第二鏈的過程實際已經(jīng)包含在PCR過程中了，并且很多論文做RT-PCR的也是直接以cDNA第一鏈作為模板。請問下大家，我這樣理解是不是對的？另外想到一個問題，以cDNA第一鏈作為模板進行PCR和以DNA雙鏈為模板進行PCR，兩種PCR試劑盒有沒有區(qū)別，主要區(qū)別有哪些？謝謝大家了 |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
飄雪3889: 金幣+10, ★★★很有幫助, 我前些天已經(jīng)明白了，不過還是要感謝您 2013-12-24 16:28:23
感謝參與，應助指數(shù) +1
飄雪3889: 金幣+10, ★★★很有幫助, 我前些天已經(jīng)明白了，不過還是要感謝您 2013-12-24 16:28:23
| 以單鏈cDNA為模板做PCR沒有問題，和雙鏈DNA模板的區(qū)別是在反應第一個循環(huán)時，只有一條引物（與cDNA互補的那條）發(fā)生反應。第一個循環(huán)過后就生成了兩條互補的DNA鏈，接下來的過程就是完全相同的了。做RT-PCR都是用單鏈cDNA直接P的。我不知道你說的PCR試劑盒是什么。反轉率的試劑盒通常也只能合成第一條cDNA鏈，如果要獲取雙鏈cDNA，通常是把RNA模板消化掉后在進行PCR獲得。通常用于PCR的盒子無外乎包括buffer, Mg2+, dNTP，酶，這些都是普通PCR反應所必需的，應該沒有太大區(qū)別。如果要做熒光定量，還有熒光染料。 |
2樓2013-12-23 07:31:58
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