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liangpz鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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關(guān)于TAKARA的RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)~ 已有3人參與
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最近買(mǎi)了TAKARA的RT-PCR試劑盒，RR014A，說(shuō)明書(shū)倒是很詳細(xì)，但還是有地方不太明白，希望有用過(guò)的前輩指點(diǎn)指點(diǎn)啊~~ 1 反轉(zhuǎn)錄前有個(gè)變性退火的過(guò)程，65℃ 5 min，接著有個(gè)4℃，但沒(méi)說(shuō)多長(zhǎng)時(shí)間，是怎么個(gè)意思呢？加了反轉(zhuǎn)錄酶后的延伸部分也有 同樣的問(wèn)題，只有4℃，沒(méi)有多長(zhǎng)時(shí)間~ 2 試劑盒里面帶的三個(gè)反轉(zhuǎn)錄引物，Oligo dT Primer，Random 6 mers和Specific Primer，做未知基因的話(huà)，前兩個(gè)之中哪個(gè)好一點(diǎn)呢？ 3 還有就是PCR部分說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)了兩步法和三步法，這又是怎么回事？一般不是只有一步法和兩步法嗎，三步法是什么意思？ |
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西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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myprayer: 金幣+5, MolEPI+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-28 11:42:55
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1.4℃是產(chǎn)物保存的溫度，4℃前的反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束啦，可以收了。儀器上4℃這步你可以設(shè)成無(wú)窮大，或者24小時(shí)之類(lèi)的，萬(wàn)一沒(méi)有及時(shí)收，產(chǎn)物在4℃下也能存很久。 2. Specific Primer是針對(duì)已知基因?qū)ｉT(mén)設(shè)計(jì)的，試劑盒上應(yīng)該是沒(méi)有的哦。 你的是未知基因，Oligo dT Primer和Random 6 mers建議一起用，更容易獲得全長(zhǎng)的RNA。 3.“PCR部分說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)了兩步法和三步法”這個(gè)是針對(duì)PCR程序說(shuō)的。這里的兩步是指退火和延伸用同一個(gè)溫度，三步則是傳統(tǒng)PCR的變性、退火、延伸都用不同溫度。兩步法因?yàn)椴挥米兓瘻囟�，PCR耗時(shí)相對(duì)較短；三步法則可以有效提高反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率。時(shí)間充裕的話(huà)還是用三步法吧。 你說(shuō)的一步法和兩步法指的是反轉(zhuǎn)錄和定量PCR這兩個(gè)過(guò)程是不是在一起。通俗地說(shuō)，如果你先做反轉(zhuǎn)錄，然后取cDNA出來(lái)再做定量PCR，這個(gè)叫做兩步法；如果你一次性把反轉(zhuǎn)錄和定量PCR的東西都加到一個(gè)管子里，反轉(zhuǎn)錄之后不開(kāi)蓋，直接做定量PCR，這個(gè)叫做一步法（不是所有試劑盒都能用一步法的哈，不清楚時(shí)別亂來(lái)  ）。一步法比較省事，而且不開(kāi)蓋可以降低污染幾率，但是反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA只能用一次，適合土豪；兩步法的話(huà)比較省東西，得到的cDNA可以多次使用。我建議你用兩步法。 |
2樓2013-12-27 22:21:48
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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對(duì)于原核RNA樣品，一般有室溫25°C 5-10分鐘這一步，而真核RNA樣品，一般加酶之前最好對(duì)模板進(jìn)行預(yù)變性,70°C左右吧，不同盒子會(huì)有些不同。這一步是讓模板處于正確狀態(tài)便于逆轉(zhuǎn)錄酶工作的。第二步通常是逆轉(zhuǎn)錄酶工作的溫度，通常是42°C。之后應(yīng)該有一步逆轉(zhuǎn)錄酶失活，通常是85°C左右，然后降溫至4°C。 |
4樓2013-12-28 07:09:30
liangpz
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6樓2013-12-28 09:59:21
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9樓2013-12-28 20:26:56
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