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關于TAKARA的RT-PCR試劑盒說明書~ 已有3人參與
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最近買了TAKARA的RT-PCR試劑盒，RR014A，說明書倒是很詳細，但還是有地方不太明白，希望有用過的前輩指點指點啊~~ 1 反轉錄前有個變性退火的過程，65℃ 5 min，接著有個4℃，但沒說多長時間，是怎么個意思呢？加了反轉錄酶后的延伸部分也有 同樣的問題，只有4℃，沒有多長時間~ 2 試劑盒里面帶的三個反轉錄引物，Oligo dT Primer，Random 6 mers和Specific Primer，做未知基因的話，前兩個之中哪個好一點呢？ 3 還有就是PCR部分說明書上寫了兩步法和三步法，這又是怎么回事？一般不是只有一步法和兩步法嗎，三步法是什么意思？ |
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1.4℃是產物保存的溫度，4℃前的反應已經結束啦，可以收了。儀器上4℃這步你可以設成無窮大，或者24小時之類的，萬一沒有及時收，產物在4℃下也能存很久。 2. Specific Primer是針對已知基因專門設計的，試劑盒上應該是沒有的哦。 你的是未知基因，Oligo dT Primer和Random 6 mers建議一起用，更容易獲得全長的RNA。 3.“PCR部分說明書上寫了兩步法和三步法”這個是針對PCR程序說的。這里的兩步是指退火和延伸用同一個溫度，三步則是傳統(tǒng)PCR的變性、退火、延伸都用不同溫度。兩步法因為不用變化溫度，PCR耗時相對較短；三步法則可以有效提高反應的特異性和擴增效率。時間充裕的話還是用三步法吧。 你說的一步法和兩步法指的是反轉錄和定量PCR這兩個過程是不是在一起。通俗地說，如果你先做反轉錄，然后取cDNA出來再做定量PCR，這個叫做兩步法；如果你一次性把反轉錄和定量PCR的東西都加到一個管子里，反轉錄之后不開蓋，直接做定量PCR，這個叫做一步法（不是所有試劑盒都能用一步法的哈，不清楚時別亂來  ）。一步法比較省事，而且不開蓋可以降低污染幾率，但是反轉錄出來的cDNA只能用一次，適合土豪；兩步法的話比較省東西，得到的cDNA可以多次使用。我建議你用兩步法。 |
2樓2013-12-27 22:21:48
西瓜
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