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永遠(yuǎn)一片天新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
求雙酶切連接、載體構(gòu)建等信息~ 已有2人參與
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| 最近學(xué)習(xí)雙酶切，但太泛了，完全沒(méi)有頭緒，如何在引物兩端加酶切位點(diǎn)也一頭霧水，如何選擇載體？如何構(gòu)建載體？？等等 |
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 實(shí)驗(yàn)求助 |
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sxxuan
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網(wǎng)上有個(gè)表是關(guān)于怎么添加保護(hù)堿基的，不同酶切位點(diǎn)選擇不同的保護(hù)堿基有利于增加酶切效率。上網(wǎng)一搜就出來(lái)了。然后設(shè)計(jì)引物的時(shí)候分別在酶切位點(diǎn)前面增加就好 |
永遠(yuǎn)一片天
7樓2014-01-06 14:10:05
lvbobo823
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| 雙酶切不應(yīng)該覺(jué)得太麻煩，就是把兩種酶在合適的Buffer里工作就可以了。引物前加酶切位點(diǎn)也很好弄，把自己需要用的酶切序列添加到引物前段保證引物匹配序列不低于15bp就好。同時(shí)在酶切位點(diǎn)前加幾個(gè)保護(hù)堿基。載體選擇根據(jù)你的需要定，有合適的酶切位點(diǎn)。構(gòu)建也一樣根據(jù)需要。 |
2樓2014-01-02 08:57:09
sxxuan
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永遠(yuǎn)一片天: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-01-03 21:53:01
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你可以看看pET原核表達(dá)手冊(cè)，里面講了很多理論知識(shí)，雖然主要是原核表達(dá)載體方面的構(gòu)建，但也可以滿(mǎn)足你的需求。 另外不知道你做雙酶切構(gòu)建載體是用于哪一方面，所以是不能具體地和你講怎么做到。不管怎樣，選擇酶切位點(diǎn)或者載體構(gòu)建，都是和你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约靶蛄邢嚓P(guān)。酶切位點(diǎn)不能是目的序列里面有的，做上下游加入酶切位點(diǎn)的方向要與載體的方向一致。 很多酶的廠家，例如takara/neb/fermentas等網(wǎng)站上都有相關(guān)的技術(shù)手冊(cè)，可以參考。 |
3樓2014-01-02 09:28:36
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4樓2014-01-03 21:59:51
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