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[求助] 關(guān)于PCR擴(kuò)不出的問題，求大神解答已有5人參與

大家好：我現(xiàn)在PCR的時(shí)候遇到了一個(gè)問題，我根據(jù)小麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，想設(shè)計(jì)幾對(duì)引物做熒光定量，擴(kuò)增長度大約100bp左右。但是，我想先用基因組DNA，用普通的PCR儀摸一下條件，卻怎么也擴(kuò)不出目的帶（只有模糊的引物帶），用touchdown程序也不行。用cDNA直接熒光定量更是定不出來，可我設(shè)計(jì)引物的時(shí)候都盡量避開了引物二聚體或者錯(cuò)配，這是咋回事�。壳蟠笊窠獯�，著急啊

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1樓 2014-01-24 13:04:57

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lwk5716: 金幣+1, ★有幫助 2014-01-28 15:51:32

你是根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR，同時(shí)多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物，畢竟定量引物工作要求比較高。

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hehe

5樓2014-01-24 19:46:39

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冰封之real

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lwk5716: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-01-28 15:54:23

既然是小麥基因組，那LZ就得考慮內(nèi)含子的問題，要試也不能拿基因組試，而是用cDNA進(jìn)行普通PCR，如果能得到所需條帶，再上熒光定量PCR。如果得不到，那就是引物有問題（也有可能是cDNA有問題，不過這個(gè)可能性不大）

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8樓2014-01-26 09:29:32

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若溪

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-01-24 16:11:08

我覺得你可以先用通用引物進(jìn)行PCR，以確認(rèn)模板沒有問題，如果模板沒有問題那就可能是引物本身設(shè)計(jì)的有問題

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沒有比腳更長的路，沒有比人更高的山

2樓2014-01-24 15:46:37

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我的序列來自轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，只是部分的mRNA序列，我是根據(jù)這個(gè)序列設(shè)計(jì)的。還有，怎么用通用引物PCR？

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3樓2014-01-24 19:04:10

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 若溪 at 2014-01-24 15:46:37
我覺得你可以先用通用引物進(jìn)行PCR，以確認(rèn)模板沒有問題，如果模板沒有問題那就可能是引物本身設(shè)計(jì)的有問題

我的序列來自轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，只是部分的mRNA序列，我是根據(jù)這個(gè)序列設(shè)計(jì)的。還有，怎么用通用引物PCR？

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4樓2014-01-24 19:04:39

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6樓2014-01-24 22:41:19

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gyesang

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實(shí)際上你是拿RNA為模板來設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物長度為100bp，你有看過你設(shè)計(jì)的引物在基因組序列上的位置嗎，萬一它們跨內(nèi)含子而使PCR產(chǎn)物變得很長，而你擴(kuò)增不出來是你延伸時(shí)間不夠?qū)е碌?br />
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7樓2014-01-25 04:06:59

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5樓: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-24 19:46:39
你是根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR，同時(shí)多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物，畢竟定量引物工作要求比較高。

嗯，謝謝你。

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9樓2014-01-28 15:49:24

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7樓: Originally posted by gyesang at 2014-01-25 04:06:59
實(shí)際上你是拿RNA為模板來設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物長度為100bp，你有看過你設(shè)計(jì)的引物在基因組序列上的位置嗎，萬一它們跨內(nèi)含子而使PCR產(chǎn)物變得很長，而你擴(kuò)增不出來是你延伸時(shí)間不夠?qū)е碌?br /> ...

嗯，是的。不過，現(xiàn)在基因組數(shù)據(jù)不全，我延長一下時(shí)間試試吧，謝謝你。

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10樓2014-01-28 15:54:08

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