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lingbi銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
T載體上的酶切位點(diǎn) 已有3人參與
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正在設(shè)計(jì)目的基因，上下游分別是EcoRI \BamHI ,請(qǐng)問(wèn)，如果我將PCR產(chǎn)物連在T載體上送測(cè)序，回頭再將目的片段切下來(lái)可不可以？看到T載上也有這兩個(gè)位點(diǎn)會(huì)不會(huì)切下來(lái)的切多了連在表達(dá)載體上讀碼框移位之類(lèi)的麻煩？請(qǐng)問(wèn)大家怎么解決的？ T.jpg |
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lvbobo823
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3樓2014-02-23 19:15:01
atlanticwi
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... 問(wèn)題1. 可以T載體測(cè)序后再酶切連接目的載體 但其實(shí)最后在目的載體上測(cè)序比較合適 問(wèn)題2. 載體自有酶切位點(diǎn)的，很有可能會(huì)干擾你的酶切位點(diǎn)的酶切，所以請(qǐng)選用pMD19-T (simple)型T載體，此T載體沒(méi)有MCS區(qū)域，或使用其他沒(méi)有你酶切位點(diǎn)的T載體，如pGEM-T型就沒(méi)有EcoRI和BamHI 祝實(shí)驗(yàn)順利  |
2樓2014-02-23 16:38:58
shiyiyaya
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| 在T載體上測(cè)序確定正確之后再亞克隆比較好。這樣可以保證PCR之后的產(chǎn)物是正確的。一般亞克隆不會(huì)改變目的基因的序列。而且酶切問(wèn)題，只要酶切位點(diǎn)外側(cè)有幾個(gè)保護(hù)堿基，就會(huì)消化干凈，所以此處不必?fù)?dān)心酶切不完全的問(wèn)題。祝順利！ |
4樓2014-02-23 20:37:00
lingbi
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5樓2014-02-24 12:16:56
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