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xujingyuanxu

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[求助] 求助：ISSR擴(kuò)增條帶問(wèn)題解決已有1人參與

各位大神好，本人最近在做ISSR的分子標(biāo)記，有幾個(gè)問(wèn)題想求助：1、擴(kuò)增不同地區(qū)的植物樣本如圖，擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠后，總是看著有白色的拖尾，且條帶之間不如文章上附圖那么清晰可辨，不知道是什么原因；2、跑出來(lái)的條帶會(huì)呈現(xiàn)成啞鈴型，有時(shí)候一排膠跑的還呈現(xiàn)波浪狀狀，不明白什么原因，請(qǐng)大神指點(diǎn)！

hp 2014-01-14.jpg

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1樓 2014-02-27 22:08:36

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xujingyuanxu

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2樓: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 23:08:06
啞鈴狀第一是上樣量少了，還有就是膠做好的時(shí)間比較長(zhǎng)，有點(diǎn)干了。您可以先把膠放在電泳池中泡一下再上樣，可能會(huì)好一點(diǎn)。
拖尾是由于PCR的問(wèn)題，有些污染吧。您看您有的梳孔處都有亮點(diǎn)，這很可能是某些污染。

謝謝您！我在提取DNA的過(guò)程中，除蛋白用的是氯仿—異戊醇，沒(méi)有加酚，是不是處理蛋白不徹底�。科浯�，我沒(méi)有用RNA酶處理，您覺(jué)得有什么影響么？RNA會(huì)不會(huì)放一段時(shí)間就自動(dòng)降解了�。康谌�，我PCR之前模板只是上了電泳，和marker進(jìn)行對(duì)比，沒(méi)有用吸光度測(cè)濃度，另外模板有時(shí)會(huì)特別亮，梳孔處有亮點(diǎn)，是因?yàn)榈鞍走€是多糖雜質(zhì)呢？稀釋一下可以么？謝謝您的幫忙！

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3樓2014-02-28 21:50:14

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新人小玥

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xujingyuanxu: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-02-28 21:51:15

啞鈴狀第一是上樣量少了，還有就是膠做好的時(shí)間比較長(zhǎng)，有點(diǎn)干了。您可以先把膠放在電泳池中泡一下再上樣，可能會(huì)好一點(diǎn)。
拖尾是由于PCR的問(wèn)題，有些污染吧。您看您有的梳孔處都有亮點(diǎn)，這很可能是某些污染。

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2樓2014-02-27 23:08:06

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新人小玥

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3樓: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-02-28 21:50:14
謝謝您！我在提取DNA的過(guò)程中，除蛋白用的是氯仿—異戊醇，沒(méi)有加酚，是不是處理蛋白不徹底��？其次，我沒(méi)有用RNA酶處理，您覺(jué)得有什么影響么？RNA會(huì)不會(huì)放一段時(shí)間就自動(dòng)降解了�。康谌�，我PCR之前模板只是上了電 ...

您PCR中加入的DNA模版量已經(jīng)很低了，再加上反應(yīng)體系進(jìn)一步稀釋。有雜質(zhì)什么的也都被稀釋了吧。。。。
沒(méi)有用RNA酶處理沒(méi)關(guān)系，不影響ISSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外您說(shuō)的RNA降解一般都這么說(shuō)，應(yīng)該會(huì)被降解了吧，不過(guò)不好說(shuō)
跑DNA時(shí)梳孔處的亮點(diǎn)可能蛋白多糖多酚什么的都有可能，如果不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，就不用糾結(jié)。
我覺(jué)得您的關(guān)鍵點(diǎn)是在PCR上，做ISSR時(shí)就是DNA提的再爛都能做出來(lái)的，別糾結(jié)提DNA的方法了。好好看看PCR反應(yīng)有沒(méi)有可能引入什么污染。尤其是水！

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4樓2014-03-01 06:28:30

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4樓: Originally posted by 新人小玥 at 2014-03-01 06:28:30
您PCR中加入的DNA模版量已經(jīng)很低了，再加上反應(yīng)體系進(jìn)一步稀釋。有雜質(zhì)什么的也都被稀釋了吧。。。。
沒(méi)有用RNA酶處理沒(méi)關(guān)系，不影響ISSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外您說(shuō)的RNA降解一般都這么說(shuō)，應(yīng)該會(huì)被降解了吧，不過(guò)不好說(shuō) ...

哦！原來(lái)是這樣子啊，謝謝您！我想知道PCR反應(yīng)一般可能會(huì)有哪些污染�。坷缯f(shuō)是PCR試劑交叉使用污染、實(shí)驗(yàn)室空氣不干凈、加樣的時(shí)候槍頭污染，還是有什么特別容易引入污染的？我是新人，還望指點(diǎn)！另外，我們的滅菌雙蒸水都是滅菌后裝在2ml的離心管里，然后放在-20度的冰箱里凍存，用的時(shí)候提前拿出來(lái)，當(dāng)然一次沒(méi)用完的就放在4度冰箱里保存，下次再用，這樣是不是會(huì)污染水啊？

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5樓2014-03-01 21:42:40

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