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tongyingjia

新蟲 (初入文壇)

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[求助] 小片段PCR的問(wèn)題已有3人參與

我的基因片段長(zhǎng)度為324bp，變性溫度 94度，30s
                                          退火溫度48~58每隔一度設(shè)置梯度PCR，30S
                                          延伸溫度72度，45s
                                          30個(gè)循環(huán)
但是PCR結(jié)束，跑膠的時(shí)候只看到載體的條帶，所需要的基因一點(diǎn)都沒(méi)有p出來(lái)，這是為什么呀？求大神解答��！

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1樓 2014-03-12 19:57:54

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鬼羽帝魂

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引用回帖:

8樓: Originally posted by tongyingjia at 2014-03-17 20:12:30
有目的條帶，但也有很多雜條帶。。。切膠的時(shí)候得很小心...

恩純化以后以這個(gè)為模板再擴(kuò)

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9樓2014-03-17 20:14:53

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鬼羽帝魂

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【答案】應(yīng)助回帖

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tongyingjia(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-12 21:25:58
tongyingjia: 金幣+7, ★有幫助 2014-03-17 20:06:19

只看到載體的條帶？是不是模板加的太多了？

退火溫度與用的酶有關(guān)，KOD是68，TAQ是72。

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2樓2014-03-12 20:52:26

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lvbobo823

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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tongyingjia: 金幣+7, ★有幫助 2014-03-17 20:06:35

模板太多了，再一個(gè)你設(shè)置的梯度最多到58度有點(diǎn)低吧，我們一般是到65度。

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hehe

3樓2014-03-12 21:21:00

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Lau_Kimura

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tongyingjia: 金幣+4, ★有幫助 2014-03-17 20:06:42

（1）載體構(gòu)建，除了電擊轉(zhuǎn)化效率偏低以外，暫時(shí)無(wú)出現(xiàn)樓主的案例；

（2）最直接的建議：既然PCR效果不理想，換一種驗(yàn)證思路：酶切驗(yàn)證。

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4樓2014-03-12 21:24:32

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