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仙境之橋2009金蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
重疊延伸PCR 已有3人參與
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| 本人剛開(kāi)始做重疊延伸PCR，現(xiàn)在在用重疊延伸PCR做點(diǎn)突變，之后要做表達(dá)用，兩端有酶切位點(diǎn)。現(xiàn)在有一些問(wèn)題，想請(qǐng)各位解答。我擴(kuò)兩條目的條帶的時(shí)候，嘗試了多個(gè)退火溫度，但是條帶都不單一，并且目的條帶的量很少，請(qǐng)問(wèn)如何才能使目的條帶的單一且量增加啊？另外，進(jìn)行融合的時(shí)候，我見(jiàn)貼子上說(shuō)退火溫度高一點(diǎn)，延伸時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，我想請(qǐng)教第一輪反應(yīng)如何設(shè)置啊？是按正常的反應(yīng)95℃ 5min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，再72℃ 10min，4℃ 10min，是這樣么？退火溫度怎么設(shè)置��？第二輪反應(yīng)，也是按上邊的方法么？請(qǐng)各位前輩給于解答，非常感謝。 |
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lvbobo823
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 363 (碩士)
- 金幣: 7753.3
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3樓2014-04-01 11:32:26
mars199026
銅蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
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- 在線: 9.3小時(shí)
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- 專業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-04-01 12:59:25
仙境之橋2009: 金幣+2, ★有幫助 2014-04-01 18:01:05
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仙境之橋2009: 金幣+2, ★有幫助 2014-04-01 18:01:05
| 目標(biāo)條帶不單一是否要注意下模板的問(wèn)題，我做交疊PCR時(shí)候同常將模板稀釋后按亮度比列進(jìn)行融合！也有不加引物進(jìn)行兩輪PCR的方法！退火溫度這個(gè)以前我也很糾結(jié)，現(xiàn)在一般都是55或58度直接跑沒(méi)什么問(wèn)題的，希望幫助你 |
2樓2014-04-01 09:23:23
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4樓2014-04-04 16:13:20
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