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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
反向表達(dá)載體構(gòu)建 已有1人參與
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大家好，我現(xiàn)在初學(xué)載體構(gòu)建方面知識(shí)。有2個(gè)問題查了很多資料都弄不明白。 1 PUCM-T載體插入PCR產(chǎn)物，由于PCR產(chǎn)物3‘端加A，PUCM-T載體是3’端加T，那豈不是只有正向基因的A才能和載體的T配對(duì)，反向的插入是連接不上的？ 2 構(gòu)建好的PBI121表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定時(shí)，是直接將質(zhì)粒酶切就跑電泳鑒定呢？還是酶切后PCR再電泳？一個(gè)模板上2個(gè)上游引物為什么PCR沒產(chǎn)物呢？ 不好意思，感覺很低級(jí)的問題。。。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+2 2014-05-23 16:39:33
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-05-23 17:10:55
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1 PUCM-T載體插入PCR產(chǎn)物，由于PCR產(chǎn)物3‘端加A，PUCM-T載體是3’端加T，那豈不是只有正向基因的A才能和載體的T配對(duì)，反向的插入是連接不上的？ 是的，反向連不上。不過你要注意一般只有TAQ酶才會(huì)在產(chǎn)物上帶a。一般的高保真酶的產(chǎn)物是不帶a的，你需要自己加a。如果你想克隆反向產(chǎn)物，你就得找其他酶切位點(diǎn)，或者重寫找個(gè)載體平端克隆。 2 構(gòu)建好的PBI121表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定時(shí)，是直接將質(zhì)粒酶切就跑電泳鑒定呢？還是酶切后PCR再電泳？一個(gè)模板上2個(gè)上游引物為什么PCR沒產(chǎn)物呢？ 你得先提取質(zhì)粒，然后酶切直接電泳。你也可以先pcr鑒定是否有片段插入，然后再提質(zhì)粒酶切電泳。 |
2樓2014-05-23 16:08:16
3樓2014-05-23 16:10:37
shiliyusly
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4樓2014-05-23 16:38:06
shiliyusly
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5樓2014-05-23 16:39:26
6樓2014-05-23 16:51:10
7樓2014-05-23 16:56:06
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