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[求助] 熒光定量PCR中，結(jié)果內(nèi)參基因的CT值有，但是目的基因的CT值沒有，怎么辦已有5人參與

請教各位，最近在做qRT-PCR，內(nèi)參選的是18s，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參的CT值有，但是目的基因的CT值沒有。PCR程序的循環(huán)是34，內(nèi)參的CT值到20幾了，最高都達到30了，好像高了點，因為之前做的都只有十幾左右，目的基因的CT值干脆就沒了，是不是模板的濃度太低了，（ps：我的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是稀釋過再用的），是不是通過增加模板量就可以，還是有沒有其他有問題的地方呢，請各位指教一下，謝謝！

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1樓 2014-06-08 22:52:20

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若溪

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

個人覺得有可能是cDNA模板有點低，因為以18S為內(nèi)參，一般Ct值都挺靠前的，13左右，你的都達到20幾了，另外也不排除你的熒光染料是否加的太多或本身這個基因的表達量就比較低的可能，熒光染料加的過多也會影響Ct值，我們做實驗一般設(shè)置40個循環(huán)，所以你改變起始cDNA濃度后，仍檢測不到目的基因的Ct值，建議增加循環(huán)數(shù)試一試

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沒有比腳更長的路，沒有比人更高的山

4樓2014-06-09 11:56:00

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曼舞流蘇

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kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2014-06-09 11:17:29

增加模板量只會使得Ct值更加小，我第一次做時候Ct值特別小，大都只有9左右，后來降低了模板濃度，Ct值基本上在20左右，還算是比較理想（理想Ct值應(yīng)該15-30之間，20最好），你的這種情況估計是RNA沒有取出來，或者是收到了污染（過程中管污染和八聯(lián)管），或者是提取過程中RNA降解，或者是像八聯(lián)管中加樣加錯等，自己查找一下原因。

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2樓2014-06-09 09:05:15

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 曼舞流蘇 at 2014-06-09 09:05:15
增加模板量只會使得Ct值更加小，我第一次做時候Ct值特別小，大都只有9左右，后來降低了模板濃度，Ct值基本上在20左右，還算是比較理想（理想Ct值應(yīng)該15-30之間，20最好），你的這種情況估計是RNA沒有取出來，或者是 ...

你好，謝謝指教。
我一共做了三個目的基因，就唯獨其中一個沒有，都是同一96孔板上的，有沒有可能是那個目的基因還沒檢測到，PCR反應(yīng)就已經(jīng)結(jié)束了，所以只有內(nèi)參的CT值有。因此我想是不是那個基因的表達太低了還是模板濃度太低了。謝謝

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3樓2014-06-09 10:33:39

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引用回帖:

4樓: Originally posted by 若溪 at 2014-06-09 11:56:00
個人覺得有可能是cDNA模板有點低，因為以18S為內(nèi)參，一般Ct值都挺靠前的，13左右，你的都達到20幾了，另外也不排除你的熒光染料是否加的太多或本身這個基因的表達量就比較低的可能，熒光染料加的過多也會影響Ct值， ...

謝謝，我增加濃度試試

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5樓2014-06-09 12:29:50

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