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李英英鐵蟲 (初入文壇)
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[交流]
測(cè)序公司說濃度太低，取消測(cè)序是什么情況？
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| 這是我做完挑菌，PCR后跑的電泳的圖片，然后用PCR產(chǎn)物拿去測(cè)序，測(cè)序公司說濃度太低測(cè)不了，那我應(yīng)該怎么改進(jìn) |
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2014-06-16 21:07:47, 3.66 M
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liyu0355
木蟲 (正式寫手)
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李英英(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-20 16:45:53
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
李英英(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-20 16:45:53
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菌液： 請(qǐng)您最好提供200 µl 以上新鮮菌液，裝在1.5 ml離心管中并用封口膜封好交給我們的工作人員或快遞郵寄，或者提供4ml新鮮菌液，我們可直接進(jìn)行質(zhì)粒的提取。 我們的常規(guī)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，培養(yǎng)溫度為37℃，常規(guī)抗生素為氨卞青霉素、卡那霉素、氯霉素。您的樣品如果需要特殊培養(yǎng)要求,請(qǐng)您提供4ml新鮮菌液；如果使用特殊抗生素，請(qǐng)您一定提供儲(chǔ)存液并告知濃度以及工作濃度。除此之外，您還可以提供平板菌、穿刺菌或者甘油菌。 質(zhì)粒： 如果您的質(zhì)粒純度可以達(dá)到全自動(dòng)測(cè)序的要求，即：OD260/OD280=1.6-2.0，也可以直接提供質(zhì)粒。要求濃度要求>200ng/µl，提供10 µl 以上。 我們的常規(guī)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，培養(yǎng)溫度為37℃，常規(guī)抗生素為氨卞青霉素、卡那霉素、氯霉素。您的樣品如果需要特殊培養(yǎng)要求,請(qǐng)您提供4ml新鮮菌液；如果使用特殊抗生素，請(qǐng)您一定提供儲(chǔ)存液并告知濃度以及工作濃度。除此之外，您還可以提供平板菌、穿刺菌或者甘油菌。 以下情況請(qǐng)您直接提供抽提好的DNA模板： 1. 噬菌體DNA 2. 低拷貝質(zhì)粒 3. cosmid,BAC DNA 請(qǐng)您純化DNA模板時(shí)注意：純化的DNA模板要求純度高。純化以后的DNA模板要溶解于無菌去離子水。濃度要求>200ng/µl，(載體較大的，請(qǐng)?zhí)峁?gt;500ng/µl)，提供10µl以上(一般情況下，經(jīng)測(cè)序部檢測(cè)合格后才可使用)。 無論您按照1或2提供菌液或質(zhì)粒，請(qǐng)您務(wù)必寫明： 1. 質(zhì)粒的名稱和詳細(xì)圖譜 2. 插入片段的大小和酶切位點(diǎn) 3. 選取的測(cè)序引物名稱和序列，并且標(biāo)明測(cè)序引物距離插入片段的位置(注：測(cè)序引物以后可能會(huì)有20-30個(gè)堿基不明晰) 4. 如果提供特殊測(cè)序引物，請(qǐng)寫明序列，并且一定要提供經(jīng)PAGE純化的引物，濃度大于5pmol/µl PCR產(chǎn)物： 如果您提供的是PCR原液，我們將進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化。回收后的產(chǎn)物無論測(cè)序成功與否，我們將收取一定的純化費(fèi)用，所以請(qǐng)您提供PCR原液時(shí)一定要進(jìn)行鑒定。確信PCR產(chǎn)物為單一擴(kuò)增條帶，總量必須大于2µg，方可提供，以免耽擱您的實(shí)驗(yàn)。 如果您提供純化好的PCR產(chǎn)物，條帶必須單一，純度OD260/OD280=1.6-2.0。最好溶解在滅過菌的去離子水中，濃度要求>50 ng/µl，提供10µl以上。同時(shí)請(qǐng)您提供PCR引物，并注明濃度，一定要提供經(jīng)PAGE純化的引物，濃度大于5pmol/µl。 注意事項(xiàng)： 1. PCR產(chǎn)物直接測(cè)序成功的關(guān)鍵是PCR產(chǎn)物的純度，所以我們提倡切膠回收PCR產(chǎn)物。如果有幾條PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度相近，用電泳膠也無法分開，此時(shí)的PCR產(chǎn)物便無法直接測(cè)序。這種情況建議把PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序。 2. PCR產(chǎn)物直接測(cè)序成功的另一要因是引物，不能做PCR反應(yīng)的引物便能測(cè)序。測(cè)序用引物要求較高，引物的3’端必須與模板完全其配，含有Mix堿基的引物一般不能測(cè)序（特別是3’端）。此外，測(cè)序引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，GC含量必須在50－60％左右。而且用于測(cè)序的引物一定要經(jīng)過PAGE純化，純度必須大于90％。 3. 在PCR擴(kuò)增時(shí)，難以擴(kuò)增（擴(kuò)增后的PCR帶較弱）的PCR產(chǎn)物在測(cè)序時(shí)一般成功率較低。 4. 小于150bp的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序效果不好，建議克隆后測(cè)序。 |
3樓2014-06-17 11:35:18
2樓2014-06-17 08:18:50
lijing9510
金蟲 (小有名氣)
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4樓2014-06-17 16:34:00
6樓2014-06-20 14:21:22
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