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Red重組PCR相關(guān)問題
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前期通過設計同源臂，以用pkD3中氯霉素片段替換目標基因（電泳結(jié)果、測序結(jié)果均以證明替換成功），導入pcp20質(zhì)粒，通過調(diào)整溫度，以實現(xiàn)氯霉素基因的脫除。平板驗證時菌落在氯霉素板上是無法生長的，初步表明cm基因片段應該已經(jīng)脫除了。但以原來的驗證引物（驗證氯霉素取代了目的基因所設計的引物，在目標基因上下游100 bp左右）進行PCR驗證，換過很多種酶（Takara的ex-Taq，primer star，諾唯贊的mix）并且試過溫度梯度，就是怎么也擴不出來片段。 氯霉素替換目標基因后片段大小在1200bp左右，這個和實驗現(xiàn)象是符合的，后面氯霉素脫除之后，片段大小可能小于500。想請教下各位大俠，之前是否遇到過這種情況，是怎么解決的呢，謝謝！ |
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wolfghost
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2樓2014-08-16 13:50:29
CM799183890
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3樓2016-01-08 15:15:44
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