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尋香海棠新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于菌落PCR，請教高手幾個(gè)問題！ 已有4人參與
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最開始做的時(shí)候用機(jī)器里之前師兄師姐設(shè)定的程序如下： 95℃ 3min 95℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 25s 72℃ 10min 使用通用引物，兩次都沒成功，后來發(fā)現(xiàn)延伸時(shí)間太短，設(shè)為1min30s后，7個(gè)菌成功了4個(gè)，還有3個(gè)我按照修改后的方法來做仍然沒有一個(gè)成功！這是什么回事呢？ 然后我分析可能是預(yù)變性時(shí)間太短，沒有將細(xì)胞壁裂解，打算設(shè)為10min，同時(shí)擔(dān)心挑入培養(yǎng)基進(jìn)入體系干擾實(shí)驗(yàn)，打算將液體培養(yǎng)的菌液離心取適量菌體。 請問大神這樣做合不合適？還有什么可以改進(jìn)的嗎？ |
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5樓2014-07-05 12:13:36
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4樓2014-07-05 09:52:43
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6樓2014-07-05 21:46:59
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尋香海棠(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-06 17:47:26
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就我做實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，菌液比菌落難擴(kuò)的多，菌液濃度比菌落要高很多，換句話說，就是你不好掌控PCR體系中模板的量。 只要你的PCR體系合適，PCR體系中沾點(diǎn)瓊脂完全不是問題。 目前你擴(kuò)不出16s，主要有兩個(gè)原因，一是引物不合適，二是程序或體系不合適。 雖然是通用引物，但并不一定合適你的菌。你可以自己嘗試設(shè)計(jì)一下，或者去網(wǎng)上找找16s的通用引物，你會發(fā)現(xiàn)通用引物的序列并不是只有一種，建議你嘗試一下其他的。 有關(guān)PCR的體系和程序，要看你用哪一種酶。比如說takara的easytaq，你可以去網(wǎng)上找到它的說明書，說明書里就有PCR體系和程序，不要再沿用師兄師姐的程序和體系了，那不一定合適。一般變性這一步對于細(xì)菌菌落PCR來說不是很重要，延長到10min也不會有很好的效果。 祝實(shí)驗(yàn)順利！  |
7樓2014-07-05 21:48:09
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10樓2014-07-07 16:39:16
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