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張冰寶新蟲 (小有名氣)
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[求助]
目的片段回收后濃度較低，如何濃縮？ 已有6人參與
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| 我回收了我的目的片段，條帶很暗且稍偏高，濃度有些低，連接表達(dá)載體一直連接不上，希望可以把我的目的片段濃縮一下。不知道該如何濃縮，希望知道的大俠們指點(diǎn)一下 謝謝 |
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 生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法 | 實(shí)驗(yàn)問題 |
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9樓2014-07-09 08:11:37
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2樓2014-07-07 16:19:56
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15樓2014-07-10 11:29:57
24樓2014-07-21 09:02:25
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嗯，這就是 常規(guī)的載體構(gòu)建方法嘛。但是你的問題我還是不明白，越來越來越不明白了。 根據(jù)載體構(gòu)建的常規(guī)步驟，1）PCR擴(kuò)增目的基因，你原始的問題就是這步的擴(kuò)增目的基因的時(shí)候條帶不亮，我建議用回收片段再重新擴(kuò)增。但是你有標(biāo)準(zhǔn)菌株的模板，而且你陽性對照也是很亮的，所以就不明白你的問題了。2）回收片段連接T-vector→測序→酶切→回收目的條帶，如果你的問題是這步的回收條帶不亮，那我當(dāng)初的建議就是不可行的。這樣的話，那是你酶切的質(zhì)粒濃度不夠，所以建議你重新提取這個(gè)中間載體的質(zhì)粒，提高下濃度，你可以直接放在37℃的烘箱，開蓋烘過夜，會蒸發(fā)一些水分，質(zhì)粒的濃度就會提高些，你用這個(gè)酶切，回收，在連接你的表達(dá)載體。 |
27樓2014-07-21 10:01:36
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你連上T載體測序除了一個(gè)點(diǎn)突變其他的位置正確對吧，你現(xiàn)在的問題是1.你切膠回收后比較暗，2.條帶偏大，3.以膠回收產(chǎn)物二次PCR無條帶。 針對第一點(diǎn)，首先你要考慮你酶切完全不完全~或者你的酶切位點(diǎn)甲基化導(dǎo)致切割困難，酶切時(shí)間短自然你基因條帶弱 針對第二點(diǎn)，T載體上也是有不少酶切位點(diǎn)的，如果你的酶切時(shí)間不夠或酶切位點(diǎn)甲基化，切割出現(xiàn)在載體的酶切位點(diǎn)上自然你要回收的序列會偏大。 針對第三點(diǎn)，你割膠回收后測過濃度嗎？你的條帶本身就很弱我估計(jì)你回收完都沒東西了。 所以最好的解決辦法就是延長切割時(shí)間，其次篩查你加的酶切位點(diǎn)是否有甲基化酶識別區(qū)導(dǎo)致甲基化。你有你酶切質(zhì)粒的電泳圖嗎？能不能發(fā)出來看看你的圖 |
28樓2014-07-21 10:57:50
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57樓2014-07-23 19:17:13
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