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zhaoxiaopang金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
酶切連接連不上，要死了 已有10人參與
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| 如題，最近構(gòu)建質(zhì)粒，載體是pIMP，使用的是單酶切位點(diǎn)Nde1.然后用一步克隆的方法做連接轉(zhuǎn)化，感受態(tài)是DH5&，做了四五次都是連不上，長(zhǎng)出來(lái)的單菌落做PCR結(jié)果目的條帶都P不出來(lái)，不知道是什么原因。換了新的一步克隆試劑盒做對(duì)比依然還是連不上，求大神分析分析啊。。。。。。 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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金蟲(chóng) (小有名氣)
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4樓2014-07-09 11:13:21
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2樓2014-07-08 16:25:35
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoxiaopang(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-11 11:09:24
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoxiaopang(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-11 11:09:24
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有好多原因呢 不如詳細(xì)說(shuō)說(shuō)你的實(shí)驗(yàn)過(guò)程 我前兩天構(gòu)建質(zhì)粒也是遇到了問(wèn)題，現(xiàn)在找到原因了 是因?yàn)槊盖袝r(shí)間太長(zhǎng)了（說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)著過(guò)夜不會(huì)出現(xiàn)星號(hào)活性，我切4個(gè)小時(shí)就不行了）。 |
3樓2014-07-09 08:48:17
王寶明WANG
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zhaoxiaopang(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-11 11:09:43
zhaoxiaopang(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-11 11:09:43
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我的外源片段是8000bp（CLA1，PAC1雙切）想與腺病毒骨架（28000bp)連接，小弟目前已經(jīng)連接一年之久，但就是連接不上，每次轉(zhuǎn)化長(zhǎng)的斑很少，最多時(shí)也不超過(guò)30個(gè)。麻煩大神們幫幫，謝謝了。 目前我想到的方法有：1、換了商用化的DH5感受態(tài) 2、換了不同的腺病毒載體 3、換了不同的連接酶 4、摸過(guò)不同的連接比例 我認(rèn)為可能有點(diǎn)問(wèn)題：1、我的酶切產(chǎn)物都是一直放在四度 ，有可能有部分降解。 |
5樓2014-07-09 15:30:24
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