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[交流]
酶切后的補(bǔ)平連接 已有4人參與
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我正在構(gòu)一個長片段的載體，3500的基因往6100的載體上連。 但載體上對應(yīng)基因的酶切位點(diǎn)很少，用MBI的快速酶切載體和基因，基因的上游只能用平末端酶，構(gòu)載體時上游沒有合適的酶切位點(diǎn)，只能用一個普通的酶切割后，再用補(bǔ)平酶將其末端補(bǔ)平，然后再進(jìn)行第二次酶切，下游的酶切位點(diǎn)是粘性末端，雙酶切產(chǎn)物純化后連接。 我現(xiàn)在遇到的問題是載體經(jīng)過第一次單切，末端補(bǔ)平，第二次單切純化后與基因相連（基因是這兩個酶同時切，上游平下游粘），但就是連不上。MBI的說明書上說快速酶，補(bǔ)平酶的buffer可以通用，效率都可達(dá)到100%，因此在第一次單切后補(bǔ)平時就沒有純化，直接在里面加上補(bǔ)平酶，反應(yīng)結(jié)束后，再加一些第二次單切的酶，最后再純化。 我想問一下，在這個一次單切，補(bǔ)平，二次單切的過程中是不是有什么需要注意的事項，我現(xiàn)在懷疑我的載體要么有一個酶沒有切開，要么就是補(bǔ)平不完全，導(dǎo)致與基因的雙酶切產(chǎn)物連不上。 |
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