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swach鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
轉化有菌落，挑菌轉板擴大培養(yǎng)之后，菌落PCR沒有條帶 已有2人參與
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| 轉化之后有單菌落，挑單菌落到另一個板子上擴大培養(yǎng)，今天挑菌破壁之后，做菌落PCR，沒有目的條帶，全部是拖帶。轉化之后的板子上面單菌落有藍白斑出現，不知道問題出在哪里？轉化之后的單菌落長得很好，以為能成功的，同學最近也遇到了同樣的問題。難道是轉化之后的那些單菌落全都是氨芐失效長出來的雜菌嗎？還是其實都是空載，只是藍斑沒有篩選出來。大前天倒得板子，在工作臺里面放了兩天，昨天轉板，今天早上板子上出了轉化的菌落，還出現了單菌落。是氨芐失效了嗎？真的很急，希望大家給予意見！我的氨芐是七月四號配的，不會失效吧？ |
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swach
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4樓2014-07-26 13:18:50
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數 +1
gyesang: 金幣+4, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-25 22:02:51
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gyesang: 金幣+4, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-25 22:02:51
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你的amp配制之后是放在哪兒？如果是室溫有失效的危險，如果是-20度冰箱是沒問題的，冰箱里可以放很久。至于你倒的板子，應該是放在4度冰箱里靠譜一些。 第一次單菌落藍白斑出現后，可以直接就用白斑做菌落PCR的，沒有必要挑擔菌落到另一個板子上擴大培養(yǎng)。你挑得單菌落擴大培養(yǎng)出來的菌落和你挑得是同源，不管你從擴大培養(yǎng)的上面pcr多少個單菌落，都和pcr前面你挑的那個單菌落一樣。假使你挑出來擴大培養(yǎng)的那個單菌落是假陽性的話，那么你后來再怎么做pcr也得不出目的條帶的。 你說‘出現了單菌落’是指菌落很密集，但菌落很少么？如果滿板子都是菌落，那么假陽性的可能性很大。如果你之前轉化的菌液有存在4度冰箱，可以拿出少量來再涂板，藍白斑篩選。試著減少涂板的菌液量，讓板子菌落數減少，這樣可以更容易挑擔菌落。藍白斑篩選后，直接挑一二十個做菌落pcr就好 最后就是，你的pcr用的引物可信么？是通用引物的話，可以同時挑藍斑pcr作對照。如果不是的話，優(yōu)化你的pcr方案，保證你的引物是工作正常的， |
2樓2014-07-25 20:03:47
luwei13566
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【答案】應助回帖
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swach(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-26 17:01:10
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swach(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-26 17:01:10
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1.氨芐在現在這個溫度下放兩天夠嗆啊。平板倒好了在超凈臺放半個小時凝固了平板口一封直接放4度了，怎么能在外面一直放，你配的那個氨芐是咋保存的啊，是不是分裝了放-20度？ 2.LZ你這個實驗是怎么做的，你是在轉化后涂布在平板上，長出來的轉化子挑白斑在另一個板子上扎了個氨芐母板，之后用母版上的菌做的菌落PCR沒條帶，還拖尾？ 你現在的問題是，菌落PCR的可靠性，氨芐的可靠性，和藍白斑的陽性率。氨芐的可靠性最重要。 如果想徹底篩查的話，你最好先做個質�？焯�，先看看你母版上的轉化子有沒有質粒，如果你的轉化子連質粒都沒有的話，氨芐重配，實驗重來。一旦有質粒的話，如果你連的基因本身就很大直接大小就可以判斷是否空載來，如果全是空載，那你就篩查一下第一步藍白斑篩選，按理說肯定有假陽性，但是如果全是假陽性也是很不正常的，你的藍白斑比例是多大�。恐劣谀愕木銹CR如果剛開始接觸的話最好陽性對照和陰性對照都加上，再重復幾次不要有大量拖帶才行. |
3樓2014-07-25 22:53:42
swach
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5樓2014-07-26 13:28:52
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