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珍藏版怡銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
新手求助~關(guān)于克隆的若干問題~ 已有4人參與
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最近克隆一個2300bp左右的片段，用的是p-GEMT載體�？偸沁B接不上，不知道是哪里出了問題~ PCR產(chǎn)物膠回收純化后~ 連接體系：PCR產(chǎn)物 3 ul buffer 5ul 載體 1ul T4連接酶 1ul 4度過夜連接，感受態(tài)用的是全是金的trans-t1.全量連接產(chǎn)物加到50ul感受態(tài)冰浴半小時，42.4度熱激90s，冰浴3分鐘，加LB（不含AMP）400u 37度孵育一小時，， l取80ul涂平板，用了藍白斑篩選，板長的挺好的 但是挑了24個沒有一個連接上的~已經(jīng)做了幾次了 不知道是哪里出了問題。。 另外，想問下載體和產(chǎn)物的比例是什么樣比較合適~都是按實驗室?guī)熜謳熃愕捏w系加的不知道比例這回事，， 新手還望大家多多指教 先謝過了。。。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-27 19:20:12
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我也是新手，前段時間剛做了干擾載體的構(gòu)建，我就實驗過程是這樣的 連接體系：PCR產(chǎn)物 2ul dd水 5ul 10*T4 ligase buffer 1ul 載體 1ul T4連接酶 1ul 16度pcr儀過夜連接，感受態(tài)用的是全是金的trans-t1.全量連接產(chǎn)物加到感受態(tài)(10ul：50ul)冰浴半小時，42度熱激60s，迅速冰浴2分鐘，加LB（不含AMP）400u 37度孵育2h,然后就涂板，結(jié)果很好，然后我又做酶切，測序驗證，都沒有問題。過程就是這樣的，我只是把我的實驗記錄寫下來了，你看看吧，希望對你有幫助。 |
2樓2014-07-27 11:02:43
hailey
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