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珍藏版怡銀蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
新手求助~關(guān)于克隆的若干問(wèn)題~ 已有4人參與
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最近克隆一個(gè)2300bp左右的片段，用的是p-GEMT載體�？偸沁B接不上，不知道是哪里出了問(wèn)題~ PCR產(chǎn)物膠回收純化后~ 連接體系：PCR產(chǎn)物 3 ul buffer 5ul 載體 1ul T4連接酶 1ul 4度過(guò)夜連接，感受態(tài)用的是全是金的trans-t1.全量連接產(chǎn)物加到50ul感受態(tài)冰浴半小時(shí)，42.4度熱激90s，冰浴3分鐘，加LB（不含AMP）400u 37度孵育一小時(shí)，， l取80ul涂平板，用了藍(lán)白斑篩選，板長(zhǎng)的挺好的 但是挑了24個(gè)沒(méi)有一個(gè)連接上的~已經(jīng)做了幾次了 不知道是哪里出了問(wèn)題。。 另外，想問(wèn)下載體和產(chǎn)物的比例是什么樣比較合適~都是按實(shí)驗(yàn)室?guī)熜謳熃愕捏w系加的不知道比例這回事，， 新手還望大家多多指教 先謝過(guò)了。。。 |
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鬼羽帝魂
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9樓2014-07-28 11:21:59
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-27 19:20:12
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我也是新手，前段時(shí)間剛做了干擾載體的構(gòu)建，我就實(shí)驗(yàn)過(guò)程是這樣的 連接體系：PCR產(chǎn)物 2ul dd水 5ul 10*T4 ligase buffer 1ul 載體 1ul T4連接酶 1ul 16度pcr儀過(guò)夜連接，感受態(tài)用的是全是金的trans-t1.全量連接產(chǎn)物加到感受態(tài)(10ul：50ul)冰浴半小時(shí)，42度熱激60s，迅速冰浴2分鐘，加LB（不含AMP）400u 37度孵育2h,然后就涂板，結(jié)果很好，然后我又做酶切，測(cè)序驗(yàn)證，都沒(méi)有問(wèn)題。過(guò)程就是這樣的，我只是把我的實(shí)驗(yàn)記錄寫(xiě)下來(lái)了，你看看吧，希望對(duì)你有幫助。 |
2樓2014-07-27 11:02:43
hailey
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3樓2014-07-27 11:05:12
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4樓2014-07-27 14:42:18
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