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質(zhì)粒酶切條帶問(wèn)題 已有2人參與
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質(zhì)粒構(gòu)建好之后沒(méi)有做酶切鑒定，直接送去測(cè)序了，測(cè)序是正確的�？涩F(xiàn)在做雙酶切時(shí)總是有些問(wèn)題。如圖： 1 marker 2 質(zhì)粒 3BamH1單酶切 4Xhol單酶切 5 雙酶切 BamH1酶切時(shí)大片段下面出現(xiàn)了兩條帶 xhol酶切時(shí)大片段上面還有一條條帶，是沒(méi)有切開(kāi)的嗎？ 雙酶切時(shí)也出現(xiàn)了大片段下面的兩條帶。不知道這個(gè)是什么。 還有因?yàn)槟康钠尾?00bp，所以前幾次做酶切時(shí)總是看不到，是因?yàn)樘×藛幔?br /> 謝謝 2014-07-27酶切.jpg |
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luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-28 08:42:27
coffee159: 金幣+4, ★★★很有幫助, 謝謝，因?yàn)楫?dāng)時(shí)是用重疊PCR的方法，通過(guò)pcr載體把目的基因插入的，所以沒(méi)辦法pcr驗(yàn)證。還有，最近提的質(zhì)粒，大小8000bp,酶切后總是在15000作用有一條帶，我不清楚這個(gè)是什么原因。質(zhì)粒不純的話測(cè)序能測(cè)出來(lái)嗎？ 2014-07-28 09:36:07
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-28 08:42:27
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1.BamHI酶切應(yīng)該是出現(xiàn)star活性了。你的基因才200bp，下面兩條帶肯定是切到載體上了，還有略微彌散，我記得這個(gè)酶穩(wěn)定性不好。最好不要長(zhǎng)時(shí)間切。 2.XhoI上面那個(gè)帶和你的質(zhì)粒對(duì)照應(yīng)該是開(kāi)環(huán)質(zhì)粒無(wú)誤。延長(zhǎng)切割時(shí)間就消失掉了。 3.雙酶切下面那兩條帶還是BamHI的star活性，至于你下面那個(gè)不亮很正常，因?yàn)槭紫饶愕幕虿灰欢ㄍ耆尫牛赡芤徊糠只蛑皇且欢吮磺虚_(kāi)，另一端還在載體上，就算你完全雙酶切后基因和載體的摩爾比是1比1，但是你的載體遠(yuǎn)大于你的基因，嵌入的EB也遠(yuǎn)比你基因多。 4.酶切效果不好可以換PCR驗(yàn)證。 |
3樓2014-07-27 23:14:27
gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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coffee159: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-07-28 09:30:50
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coffee159: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-07-28 09:30:50
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DNA染色的亮度跟片段大小和分子數(shù)直接相關(guān)，由于你的片段很小，結(jié)合的燃料也很少，所以看上去不亮，從雙酶切的結(jié)果來(lái)看，是可以看到一個(gè)小條帶的，想看到更深的條帶，可以加大酶切質(zhì)粒的量 BamHI那個(gè)可能是非特異條帶，說(shuō)不清楚 XhoI上面一個(gè)，你的質(zhì)粒那條泳道也有，可能是沒(méi)有切開(kāi)的開(kāi)環(huán)質(zhì)粒，總的來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒的質(zhì)量很好，沒(méi)有問(wèn)題 |
2樓2014-07-27 22:09:04
4樓2014-07-28 09:37:27
luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-28 15:15:03
gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-28 15:15:03
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1.其實(shí)你如果測(cè)序都正確的話不需要再做雙酶切驗(yàn)證了，而且你上面那個(gè)圖下面那條帶雖然弱，但是完全可以證明你的基因是在載體上，測(cè)序又正確那就沒(méi)啥問(wèn)題了。 2你提的質(zhì)粒酶切后那條高的條帶和你提出來(lái)的質(zhì)粒的開(kāi)環(huán)的那條帶是否一致，我估計(jì)是開(kāi)環(huán)的質(zhì)粒 3.試劑盒提的質(zhì)粒純度都可以達(dá)到測(cè)序要求 |
5樓2014-07-28 15:03:20
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